ARL15基因多態性與延邊地區2型糖尿病及糖尿病腎病的相關性

張洪江 王偉杰 邵薇 凃影葉 杜飛 楊康鵑

(1延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000；2琿春市中醫院；3延邊大學醫學院)

糖尿病腎病(DN)是2型糖尿病(T2DM)最常見的微血管病變，我國T2DM患病人數居全球首位，DN的患病率也逐年上升。DN 發病機制也在廣泛研究中，但具體發病機制尚不明確。目前普遍認為DN 的發病機制可能與遺傳因素，如微小RNA(miRNA)〔1〕、DNA甲基化〔2〕、代謝紊亂〔脂聯素(PA)、多元醇通路〔3〕、蛋白激酶C〔4～6〕等〕 、血流動力學改變、炎癥反應〔7，8〕、氧化應激(活性氧類、內質網應激)〔9～12〕等因素有關。因此，通過研究DN的發病機制，了解疾病的發生、發展，對疾病的早期干預及預防都具有重大意義。

PA與DN關系密切，研究表明在終末期腎病患者中，無論原發病是否為T2DM，均可引起PA水平升高〔13～17〕。另外，有研究表明〔18〕，早期DN可能與和肽素、PA水平升高有關。Richards等〔13〕在2009年全基因組水平上進行的一項薈萃分析發現，ADP-核糖基化樣因子(ARL15)基因rs4311394位點的突變等位基因G與T2DM相關，且G等位基因與低水平的血漿脂聯素PA水平相關。Zhao等〔14〕發現胰島素刺激可以上調ARL15表達；當ARL15過表達可以增強成C2C12 肌管中胰島素信號通路關鍵分子胰島素受體(IR)/胰島素受體底物(IRS)1/蛋白激酶B(AKT)的磷酸化，從而調節胰島素信號傳導途徑的磷酸化失調，抑制胰島素抵抗；因此提出ARL15是胰島素敏感的效應分子。另外有研究發現〔15〕ARL15是T2DM的危險因素，與總膽固醇(TC)、PA、胰島素均具有相關性，ARL15通過增加AKT和AMPK下游代謝通路促使糖原、脂肪的合成。全基因組關聯分析(GWAS)揭示了ARL15多態性與T2DM的關聯，以微血管病變為特征的DN是否與ARL15多態性相關仍有待于進一步研究。目前國內外尚缺乏ARL15基因多態性與DN相關性的研究，本研究將通過病例對照關聯分析對ARL15基因多態性位點rs35941、rs26770、rs4311394、rs645017與延邊地區朝鮮族和漢族T2DM及DN人群進行相關性分析。通過連鎖不平衡(LD)及單倍型分析，探討ARL15基因多態性位點聯合作用與ARL15、PA、胰島素等相關性，另外分析ARL15與臨床實驗室指標、PA、胰島素的相關性及對單純T2DM、DN的累加效應，為T2DM及其并發癥DN的預防和靶向治療提供遺傳學數據。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2016～2019年在延邊大學附屬醫院及琿春市中醫院單位體檢和就診患者751例。設計對照研究，將研究對象分為3組：葡萄糖耐量正常對照組(NGT組268例)朝鮮族131例，漢族137例；單純糖尿病組(T2DM組393例)朝鮮族188例，漢族205例；糖尿病腎病組(DN90例)朝鮮族35例，漢族55例，所有參與者對研究內容知情同意。診斷標準參考糖尿病診斷標準(1999年WHO標準)及2014年美國腎臟病基金會對腎臟疾病控制的臨床實踐指南(NKF-KDOQI)頒布的診斷標準。

1.2SNP位點的選取 通過NCBI SNP數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)篩選ARL15基因SNP，其最小等位基因頻率(MAF)在1 000 Genomes研究東亞人群中大于0.05。本研究納入4個ARL15基因SNP：rs35941、rs26770、rs4311394、rs6450176。

1.3實驗室指標檢測與基因組DNA的提取 收集所有參與者性別、年齡、血壓、體重指數(BMI)。清晨抽取空腹外周靜脈血于2 ml置于促凝管中，3 000 r/min離心10 min并分離血清，采用實驗室生化常規儀器檢測空腹血糖(FPG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、TC、三酰甘油(TG)。采取0.5 ml全血于二氨基聯苯胺(EDTA)-Na2抗凝管中，離心后將樣本保存于-80℃環境，所有樣本待同一時間提取基因組DNA。使用長春百奧生物技術有限公司AxyGene小量全血基因組DNA提取試劑盒，參照說明書提取全血DNA。

1.4引物的設計與合成 登錄NCBI查詢ARL15基因序列，利用Primer3軟件輔助設計引物序列(表1)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5PCR-LDR基因分型 (1)在15 μl體系中進行多重PCR擴增反應，其中樣品DNA 1～2 μl，2×PCR mix 7.5 μl，混合引物2 μl，雙蒸水補至15 μl。多重PCR反應參數：94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，45個循環。(2)在7 μl體系中進行PCR純化，其中PCR產物3 μl，ExoI 0.2 μl，FastAP 0.8 μl，ExoI緩沖液0.7 μl，雙蒸水補至7 μl；反應參數：37℃ 15 min，80℃ 15 min。(3)延伸反應，其中PCR產物2 μl，Snapshot Mix試劑1 μl，延伸引物1 μl，雙蒸水補至6 μl；反應參數：96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 30 s，30個循環。

1.6統計學處理 運用SHEsis在線軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗、等位基因和基因型頻率分析、LD分析及單倍型分析。等位基因和基因型頻率分析使用χ2檢驗計算P值和風險值(OR)。通過LD分析，計算D'值和r2值。D'=0，r2=0時，表示完全連鎖平衡；D'=1，r2=1時，表示完全連鎖不平衡狀態；|D'|≥0.8時表示存在強連鎖不平衡。使用SPSS25.0軟件進行t檢驗。

表1 SNP位點及引物

2 結 果

2.1ARL15基因分型結果 根據NGT組4個SNP rs35941、rs26770、rs4311394和rs6450176的基因型進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，4個SNP的基因型頻率在NTG組中符合遺傳平衡(P>0.05)。見圖1～4。

圖1 ARL15基因rs26770G/G，A/G，A/A位點測序

圖2 ARL15基因rs4311394C/C，C/T，T/T位點測序

圖4 ARL15基因rs6450176A/A，A/G，G/G位點測序

2.2SNPs等位基因及基因型分布 4個SNP的等位基因和基因型頻率在延邊地區朝鮮族和漢族人群之間差異無統計學意義(P>0.05)。將每組中朝鮮族和漢族人群視為同一群體，在隱性遺傳模型中，攜帶rs35941位點CC基因型頻率在DN組顯著高于T2DM組，增加T2DM患者發生DN的風險(P=0.026)，且CC基因型在DN組和NGT組也具有增加風險的趨勢(P=0.057)，但rs35941等位基因頻率在DN組與T2DM組、NGT組差異無統計學意義(P>0.05)。其他SNP的等位基因和基因型頻率在DN組與T2DM組、NGT組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5、圖6。

R/RR：參考等位基因/野生純合子；RA：突變雜合子；A/AA：突變等位基因/突變純合子圖5 NGT組漢族和朝鮮族ARL15基因SNPs等位基因和基因型頻率

R，參考等位基因；A，突變等位基因；RR，野生純合子；RA，突變雜合子；AA， 突變純合子圖6 ARL15等位基因、基因型分析

2.3LD、單倍型及聯合基因型分析 rs431139與rs6450176之間存在較強連鎖不平衡(D'=0.897,r2=0.780)，其他位點之間未發現有明顯意義的連鎖不平衡(D'或 r2<0.8)。由于rs431139與rs6450176的等位基因和基因型頻率在3組之間不存在差異，故對4個SNP的單倍型進行分析。見圖7。

位點間LD分析數值以D'-r2表示圖7 SNP位點LD分析

ARL15基因4個SNP僅rs35941位點CC基因型在隱性遺傳模型中顯示與DN相關。考慮多基因遺傳病具有微效基因累加效應特點，對單倍型和聯合基因型與疾病進行關聯分析。在單倍型分析中，僅對等位基因頻率大于0.01的單倍型進行分析，結果顯示，相對于NGT組和T2DM組，單倍型CCGA(rs35941-rs26770-rs4311394-rs6450176)與高風險DN相關(P<0.05)。相對于T2DM組，單倍型CTAG(rs35941-rs26770-rs4311394-rs6450176)與高風險DN相關(P<0.05)。見表2。

表2 單倍型、聯合基因型及其實驗室指標分析[n(%)]

隨后，聯合4個SNP的基因型，對該陽性單倍型的基因型進行分析，基因型頻率下限為0.01。結果顯示， CT-CT-AG-AG聯合基因型頻率在DN組中顯著小于NGT組(P<0.005)，同時，該聯合基因型頻率具有降低T2DM發生DN風險的趨勢。另外發現FPG和TG在T2DM組中顯著高于NGT組；HDL-C在NGT組顯著高于DN組，差異有統計學意義(P=0.005)。若將基因型頻率下限選為0.1%，與NGT組相比，CC-CC-AG-AG聯合基因型與降低T2DM風險相關(P<0.005)；相反，與T2DM組相比，CC-CC-AG-AG聯合基因型與增加DN風險相關(P<0.05)。分析該聯合基因型的實驗室檢測指標后，發現TG和PA水平在NGT組和DN組有顯著差異。由于CC-CC-AG-AG聯合基因型在T2DM組的基因型頻率過低，僅有1例，無法排除假陽性，故未對其實驗室指標進行分析。

2.4ARL15與其他實驗室指標的相關性 在DN患者中對ARL15與其他實驗室指標進行了相關性分析，發現ARL15與PA有相關性(r=0.372，0.014)，與FPG、DBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C、CRE、BUN、INS、IR無相關(r=0.061，-0.120、-0.031、-0.040、-0.073、0.149、-0.262、-0.234、-0.146、-0.050，P=0.697、0.443、0.844、0.799、0.643、0.341、0.090、0.131、0.349、0.751)。

3 討 論

T2DM是復雜的內分泌系統疾病，發病機制與遺傳和環境因素有關，不同種族之間也存在差異。ARL15基因于2009年首次通過GWAS研究被發現作為T2DM相關風險基因〔13〕。ARL15參與調節膜轉運、脂質組成和胰島素信號轉導途徑，同時也參與炎癥反應過程。PA是一種含量豐富的血漿蛋白，通過提高胰島素敏感性、改善胰島β細胞功能和脂肪酸β氧化，在 T2DM 發生和發展中起重要作用。研究表明，ARL15基因的常見遺傳變異與血漿PA、胰島素、HDL-C濃度、肥胖和冠狀動脈粥樣硬化有關〔19～22〕。近期研究發現ARL15在脂肪細胞分化和PA分泌中著重要作用，且ARL15單倍體功能不全具有導致脂肪營養不良的可能性〔23〕。因此，ARL15多態性可能與外周血PA水平相關，影響PA的分泌，PA水平降低可能引發肥胖、T2DM等代謝性疾病的發生。

以往研究分析了ARL15、TCF7L2和PGC-1α 3個基因多個SNPs在延邊地區朝鮮族和漢族人群與T2DM和T2DM合并大血管病變的相關性。對ARL15基因單個SNP進行分析時，其對T2DM的作用較小，累加其他基因位點后，可能增加罹患T2DM的風險〔24～26〕。這些研究為本研究對T2DM合并微血管病變的探究奠定了基礎，也充分說明了多基因遺傳病具有微效基因累加效應的特征。本研究首次報道了延邊地區朝鮮族和漢族人群ARL15基因多態性與T2DM和DN的關聯，分析了其單倍型及聯合基因型與DN的關聯，并進一步探討了ARL15與其他實驗室指標之間的相關性。

本實驗結果提示攜帶單倍型CCGA和CTAG人群會增加罹患DN的風險，聯合基因型CT-CT-AG-AG和 CC-CC-AG-AG可能通過調節TG和PA水平，增加IR，誘發血脂紊亂，增加T2DM罹患DN的風險。由于DN組患者例數較少且CC-CC-AG-AG基因型在T2DM組僅有1例，因此需要在更大的隊列中進行驗證。總而言之，以上研究結果從分子遺傳學機制上，為探討T2DM及DN提供了一個新的研究方向和依據。