甘草葉片形態結構和光合作用對干旱脅迫的響應

張 東 劉 艷 張 晗 張子健 王 洋 劉美岑

（1.內蒙古農業大學園藝與植物保護學院，呼和浩特 010011；2.內蒙古農業大學內蒙古野生特有蔬菜種質資源與種質創新重點實驗室，呼和浩特 010011）

植物一生固著于地面，因而更易遭受生物和非生物逆境脅迫。在長期進化過程中，植物從形態結構、生理生化等諸多方面演化形成一套完整的適應機制以抵御逆境脅迫。葉片作為地上部感知外界環境最敏感器官，其形態結構表現出與環境之間良好的適應協同性，如葉片表面蠟質可以抵御病原微生物和蟲害以及其他生物脅迫和非生物脅迫［1～2］，表皮腺體分泌物對生物脅迫和非生物脅迫［3］，角質膜調節非氣孔性蒸騰與體表溫度［4］和防御病蟲害叮咬［5～6］等。氣孔是植物葉片特有的結構，在調節植物與環境之間氣體交換、水分擴散中發揮重要作用。

干旱脅迫下植物葉片常通過調節氣孔導度，增加氣孔阻力以減少水分喪失。此外氣孔密度、氣孔大小和氣孔形態結構等也與植物抗旱性密切相關［7］。腺毛（腺體）是陸生植物地上部分表面廣泛分布的特殊結構，它們具有合成、貯存和分泌次生代謝產物以及反射強光降低葉溫、減少蒸騰等功能，在植物防御外界生物和非生物脅迫中起著重要作用。因此，了解葉片氣孔、腺體等結構特征以及對逆境脅迫的響應是闡明植物抗逆機理的重要內容。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是豆科（Leguminosae）甘草屬（Glycyrrhiza）多年生草本植物［8］，多生長在干旱、半干旱荒漠草原、沙漠邊緣和黃土丘陵地帶。其根系發達，抗性強，是荒漠半荒漠地區改良土壤、保持水土、防風固沙的重要植物。目前，關于甘草抗旱性研究多集中在植株抗氧化系統［9～11］、種子萌發特性［12］、次生代謝［13～14］等方面，對干旱脅迫下甘草葉片形態結構研究較少。本試驗采用盆栽控水模擬土壤干旱的方法，研究不同干旱脅迫程度對甘草幼苗葉片表面結構特征和光合作用的影響，旨在了解葉片表面結構對干旱逆境的響應特征，為闡明甘草抗旱機理提供重要的形態學和生理學依據。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

試驗于2018 年3 月至9 月在內蒙古農業大學實踐教學基地進行。甘草種子由內蒙古天創藥業科技股份有限公司提供。挑選充實飽滿的甘草種子，濃硫酸浸種后人工催芽，將均勻露白的甘草種子點播于花盆（高20 cm、直徑為22 cm）中，盆土以細沙和營養土5∶3 組成（V/V），每盆填充7 kg，出苗后正常管理。待幼苗長至4～5 片真葉時間苗，每盆保留生長一致、健壯苗20 株，生長2 個月后開始處理。試驗共設4 個處理，即正常供水對照（CK）、輕度干旱脅迫（light stress，LS）、中度干旱脅迫（moderate stress，MS）、重 度 干 旱 脅 迫（severe stress，SS），每處理8盆。4個處理的土壤相對含水量（SRWC）分別為75%±3.0%、65%±1.6%、50%±1.9%、35%±2.5%。自然干旱至不同處理水平，稱重控制土壤水分含量，并于每天18：00左右補充水分來保持不同干旱脅迫水平。10 d 后，不同處理植株受害程度出現明顯差異時結束處理，取樣并測定相關指標。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 土壤含水量測定

采用鮑士旦［15］的方法。

1.2.2 光合指標測定

采用CIRAS-3 便攜式光合儀（購自漢莎科學儀器有限公司）測定。每個處理隨機選取10 片植株中部成熟葉片，測定其凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）。

1.2.3 葉片掃描電鏡觀測

參照李柏年等［16］方法略有改動。取每個處理甘草植株頂端新葉、中部成熟葉和基部衰老葉，避開主脈，用刀片分別切取8 mm×5 mm的葉肉組織，2.5%戊二醛固定2 h，抽氣下沉，不同濃度乙醇梯度脫水，臨界點干燥及噴金處理，掃描電鏡觀察并照相。每個處理選取10個視野，統計氣孔密度、氣孔開張比并測量氣孔開張度。氣孔開張度為每個視野隨機選取10 個開張氣孔，測量氣孔孔徑寬度并計算平均值；氣孔開張比為每個視野中開張的氣孔數占總氣孔數的百分比。

1.3 數據處理分析

試驗數據用Excel 2013 整理，SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析，Sigma Plot軟件作圖。

2 試驗結果

2.1 干旱脅迫對甘草葉片形態結構的影響

利用掃描電鏡分別觀測不同干旱脅迫程度下、不同發育狀態（頂端新葉、中部成熟葉、基部衰老葉）甘草葉片形態結構。在葉上下表面均觀察到氣孔、腺毛和具分泌功能的腺體結構。且上述結構表現出不同葉部位、不同發育程度和不同干旱脅迫程度的差異性（見圖版Ⅰ）。

2.1.1 氣孔結構

葉片上下表皮均觀察到有大量氣孔結構存在（見圖版Ⅰ：A～B），氣孔有開張、微開張和閉合；有與葉表面相平或突出葉表面等不同形態（見圖版Ⅰ：C～F）。且氣孔形態、密度等在上下表皮間、葉片不同發育程度間、干旱脅迫處理間有顯著差異。如表1所示，不同干旱脅迫處理下，無論是新葉、成熟葉還是衰老葉，葉片下表皮氣孔密度均顯著高于上表皮，下表皮氣孔密度均值為196.0 個·mm-2，上表皮氣孔密度僅為67.2 個·mm-2。正常供水條件下，成熟葉下表皮氣孔密度最高，為260個·mm-2，其次為新葉216.7 個·mm-2，衰老葉最低，為167.3 個·mm-2；不同發育程度葉片上表皮氣孔密度差異不大，均值為74.3 個·mm-2。干旱脅迫下，葉片上下表皮氣孔總量（密度）總體均表現出較對照顯著下降的變化趨勢。其中，新葉在中度、重度脅迫下氣孔密度較對照顯著下降；成熟葉和衰老葉在輕度脅迫下氣孔密度即較對照顯著下降，且隨著脅迫程度加深，氣孔密度較對照下降幅度增加。

氣孔開放程度是影響葉片內外氣體交換和水分蒸騰的重要因素，氣孔開張比和開張度是衡量氣孔開放程度的2 個重要指標。如表1 所示，無論是正常供水的對照，還是干旱脅迫處理，植株新葉、成熟葉、衰老葉氣孔開張比均表現為上表皮大于下表皮的特征。正常供水條件下，成熟葉氣孔開張比最高，新葉和衰老葉相當，略低于成熟葉；隨著干旱脅迫程度的加劇，3種類型葉片氣孔開張比呈先升高后降低的變化趨勢，即輕度脅迫下氣孔開張比較對照有所上升，中度和重度脅迫下，氣孔開張比較對照下降。

葉片上下表皮氣孔開張度總體均值無顯著差異，分別為1.19 和1.10 μm。正常供水條件下，氣孔開張度表現為成熟葉＞新葉＞老葉；隨著干旱脅迫程度加劇，氣孔開張度同氣孔開張比變化趨勢基本一致，呈先升高后降低的變化趨勢。

2.1.2 泌腺結構

掃描電鏡觀察到甘草葉片上下表皮均具分泌功能的腺體結構（見圖版Ⅰ：G～H）。其分泌物在電鏡下呈白色透明結晶狀；分泌物在葉表面堆積，呈圓盤狀高出于葉表面，圓盤直徑約為50 μm；正常供水或輕度干旱脅迫下泌腺及其分泌物多呈光滑圓盤狀（見圖版Ⅰ：I），隨著干旱脅迫程度加劇，中度和重度脅迫下腺體及分泌物有的出現周邊皺褶，中間凹陷（見圖版Ⅰ：J），有的呈中間分泌物聚積、破損（見圖版Ⅰ：K）。泌腺在葉片上下表皮分布數量不均，在下表皮分布數量大于上表皮。正常供水條件下，新葉和成熟葉泌腺數量相當，上下表皮總量分別為7.26 和7.63 個·mm-2，衰老葉僅為5.08 個·mm-2，顯著低于新葉和成熟葉；干旱脅迫下，3種類型葉片泌腺數量均較對照有所增加。其中，輕度脅迫下，新葉和成熟葉泌腺數量即較對照顯著增加，并一直維持較高水平至中度和重度脅迫；衰老葉則在重度脅迫下泌腺數量迅速增加，顯著高于對照。

2.1.3 腺毛結構

利用掃描電鏡同時觀察到甘草葉片上下表皮具腺毛結構（見圖版Ⅰ：G～H），腺毛長約90 μm，垂直于葉表面，基部較粗，呈圓環狀，向上漸尖伸長，形似短毛。腺毛在葉肉組織和葉脈表面上均有分布。正常供水條件下，3種類型葉片上下表皮間腺毛數量無顯著差異，約為4.96 個·mm-2；干旱脅迫下，3 種類型葉片腺毛數量均有所增加，其中新葉在輕度脅迫下腺毛數量即較對照顯著增加，至中度脅迫達最多，較對照增加了174.26%，到重度脅迫下腺毛數量降至與對照相當水平；成熟葉則在中度和重度脅迫下腺毛數量顯著增加，較對照增加了203.96%；衰老葉僅在輕度脅迫下較對照有小幅增加，中度、重度脅迫下腺毛數量均與對照相當。

表1 干旱脅迫下甘草葉片表皮氣孔形態結構Table1 Leaf epidermal morphology of G.uralensis under drought stress

表2 干旱脅迫下甘草葉片表皮腺體分布Table 2 Epidermal gland density in leaves of G. uralensis under drought stress

表3 干旱脅迫下甘草葉片表皮腺毛分布Table 3 Epidermal glandular trichome density in leaves of G.uralensis under drought stress

2.2 干旱脅迫對甘草葉片光合特性的影響

葉片的主要功能是進行光合作用，干旱脅迫影響葉片的形態結構，進而對其功能造成影響。本研究測定了不同干旱脅迫程度下甘草成熟葉片光合相關指標，結果如圖2 所示。正常供水條件下，甘草成熟功能葉Pn為8.2 μmol·m-2·s-1，輕度脅迫下，葉片仍維持較高的Pn，與對照差異不顯著；中度脅迫下，葉片Pn較對照下降了23.17%，差異顯著水平；重度脅迫下，葉片僅維持極微弱的Pn。氣孔導度是表示氣孔張開程度的重要指標，隨干旱脅迫程度加深，甘草葉片氣孔導度呈先升高后降低的變化趨勢，即輕度脅迫下較對照有小幅升高，中度脅迫下較對照顯著下降，至重度脅迫氣孔導度降至極低水平。干旱脅迫下葉片蒸騰速率變化趨勢與氣孔導度一致，呈輕度脅迫下小幅升高，中度和重度脅迫下較對照顯著下降。胞間CO2濃度在正常供水和輕度脅迫下均維持相對穩定水平，約為247.5 mg·L-1；中度脅迫下Ci較對照下降了23.40%，達差異顯著水平；重度脅迫下，甘草葉片Ci迅速升高，為對照的2.4倍。

3 討論

葉片是植物進行光合作用的主要器官，氣孔是葉表面特有的形態結構，植物通過氣孔與外界環境進行水分和氣體交換，氣孔開度控制著植物的光合作用以及蒸騰作用［17～18］，從而影響葉片水勢。因此，氣孔的形態建成、分布密度以及開放程度等均直接影響植物光合作用以及蒸騰作用。大量研究均證實，氣孔在葉表面分布不均，主要分布在下表面［19］。本研究同樣觀察到，甘草葉片氣孔在下表面分布密度遠高于上表面。正常供水條件下，不同發育程度葉片表皮氣孔密度成熟葉＞新葉＞衰老葉，以及氣孔開張度也表現為成熟葉＞新葉＞衰老葉。這可能是隨著分生組織細胞成熟，最終分裂為氣孔，因而隨著葉片成熟，單位面積上氣孔數量增多［20］，然而隨著葉片衰老，氣孔也隨著發生PCD，繼而氣孔密度減小。

植物抵御干旱脅迫主動適應環境的一個重要調節因素就是氣孔調節［21］，干旱脅迫會誘導植物的氣孔出現微形態的變化，如氣孔密度增大［22］、氣孔開度減?。?3～24］、氣孔下陷、氣孔器長度和寬度顯著減小等［25］，以使植物抗性提高。本試驗結果顯示，隨著干旱脅迫程度的加劇，葉片總氣孔密度、氣孔開張比呈先增大后減小的趨勢；而氣孔開張寬度呈逐漸減小的趨勢，可能是氣孔密度的增加有助于植物更好地控制呼吸作用，調節體內H2O和CO2的進出，同時脫落酸（ABA）觸發保衛細胞釋放K+，保衛細胞滲透壓和體積的降低導致氣孔開張寬度逐漸減小，甚至關閉。與張曉艷等［26］研究發現氣孔密度隨干早程度的加劇呈先增加后減小結果一致，說明干旱脅迫程度加速了氣孔細胞的程序性死亡所造成的［27］，與趙殊麗［28］、齊紅巖等［29］、高彥萍等［30］的研究氣孔密度逐漸增大結果不同，這可能是甘草葉片具有表皮毛、腺體等適應干旱的特征，對干旱逆境脅迫具有交叉適應性，既能提高植株的抗旱能力，又能降低其在干旱環境下所受到的傷害。

旱生植物葉表皮及其附屬物發生明顯變化，如表皮毛、腺毛、瘤狀或乳狀突起等。楊九艷等［31～32］認為表皮毛反射強光使得葉片降溫，免受灼傷，可代替蒸騰作用而間接減少蒸騰用水。宋玉霞等［33］對賀蘭山幾種旱生灌木葉表皮進行了掃描電鏡觀察，認為表皮毛的附著可起到防止日灼，對葉表皮細胞和葉肉細胞均起著很大的保護作用，還可以在氣孔開放時起保護作用，減少水分的蒸騰。本試驗結果顯示，在正常供水下，泌腺及其分泌物多呈光滑圓盤狀，泌腺在葉片上下表皮分布數量不均，在下表皮分布數量大于上表皮，其中衰老葉泌腺數量顯著低于新葉和成熟葉，可能是干旱脅迫導致葉片PCD，繼而影響了泌腺發育；隨著干旱脅迫程度的加劇葉片上表皮和下表皮腺體密度總數整體上呈增大的趨勢，腺體顏色隨著干旱脅迫程度的加劇逐漸加深，形狀出現不規則褶皺和內陷，3 種類型葉片腺毛數量均比對照多，表明甘草葉片表面的腺體特征參與抗旱逆境調節，從而避免甘草植株受到干旱逆境脅迫的傷害。這與Randhawa 等［34］研究發現抗性強的品種具有數量更多的腺毛結果一致。

干旱脅迫對植物光合作用的影響范圍很廣，從限制CO2向葉綠體的擴散，限制莖和根產生的激素介導的氣孔開放，到限制CO2向葉肉運輸，以及改變葉片中光化學反應和碳代謝過程。這些影響隨著脅迫的強度和持續時間以及葉片的年齡（老葉片更容易受到干旱的影響，積累更多的鹽分）和植物種類而變化［35］。近年來的研究表明，在快速或輕度干旱條件下，氣孔限制是光合作用下降的主要原因，而緩慢干旱、中度干旱或嚴重干旱條件下，光合作用主要受非氣孔因素限制。植物受旱后，葉片光合作用受抑制的主要原因都有從氣孔因素向非氣孔因素轉變的過程，其轉變時間因植物的抗旱能力、干旱程度及施加方式等因素而異。在干旱脅迫下，植物吸水受阻導致體內水分缺乏，蒸騰速率會逐漸減緩，以維持植物基本代謝活動，這是植物抵御干旱脅迫的防御機制［36］，氣孔導度是蒸騰速率大幅度下降的主要原因。研究表明Pn與Gs和Tr呈顯著正相關，是由于氣孔在植物光合氣體交換中影響著Pn和Gs的過程，其調節能力是植物適應水分逆境的主要措施之一［37］。Valladares等［38］研究發現在小麥開花后，小麥葉片凈光合速率隨干旱脅迫程度的加劇呈先增大再減小的趨勢。本試驗結果顯示隨著干旱脅迫程度的加劇，甘草幼苗葉片的Pn、Tr、和Gs都呈現先升高后降低的趨勢；在輕度干旱脅迫時，Pn、Tr、和Gs顯著高于CK，這可能是甘草葉片表面氣孔影響所致。而Ci呈逐漸上升的趨勢，在重度脅迫時迅速增高，這與Y.Ohashi［39］等研究結果一致，表明在重度干旱脅迫下甘草幼苗失去抗旱能力，以及限制甘草幼苗光合作用的因素是由非氣孔因素導致的。