CRISPR/Cas9介導靶向敲除擬南芥BRI1突變體的鑒定

武國凡 成宏斌 吳玉俊 沈 娟 吳旺澤*

（1. 西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070；2. 蘭州大學生命科學學院，蘭州 730030）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）基因簇是細菌和古生菌基因組中廣泛存在的一種DNA重復序列家族。在該重復序列上游還存在一個多態性的Cas（CRISPR associated）蛋白家族基因，它們伴隨著細菌和古生菌的進化，形成了一種高度保守的CRISPR/Cas 系統。研究顯示，這種特殊的CRISPR/Cas 系統構成了原核生物的獲得性免疫防御系統，以抵抗外源遺傳物質的入侵［1］。所以研究者利用細菌這種特殊的CRISPR/Cas 系統，開發了繼鋅指核酸內切酶（Zinc finger endonuclease，ZFN）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技術之后發展起來的另一種基因組編輯新技術，由于它靈活、高效且易于操作，該技術已成為目前最為熱門的基因組編輯工具［2］。

根據Cas結構和功能的不同，CRISPR/Cas系統可大體分為兩類，第一類編輯系統對外源基因組的剪切需要一個較大的Cas蛋白復合物和引導RNA；第二類編輯系統對外源基因組的剪切只需要一個單一的剪切蛋白，如Cas9蛋白和cpf1蛋白。因此通過CRISPR/Cas9系統，研究者僅需基于靶基因的基因序列，合成一個含PAM（Protospacer Adjacent Motifs）序列的sgRNA 靶序列，即可通過Cas9 蛋白的核酸內切酶活性可以通過切割靶DNA并形成體內DNA 修復機制并使DNA 雙鏈斷裂（DSB）導致基因修飾，造成基因突變（如：插入，缺失和置換）［3～4］。目前CRISPR/Cas9基因編輯技術不僅在動物遺傳突變體的構建，以及遺傳性疾病治療等方面發揮重要作用，而且在作物新品種選育和作物改良中也具有重要意義［5～7］。因此，這一技術的廣泛應用，極大加快了人類對功能基因的深入研究。

油菜素內酯（Brassinosteroids，BRs）是一種天然產生的植物激素，在調控植物的生長發育過程中有重要作用［8］。當BR 合成通路或信號轉導受損時，其突變體表現出種子萌發率下降、植株極度矮小、開花時間延遲、雄性的育性能力降低、葉片延緩衰老等表型［9］。由于BRs 在植物生長發育過程中具有重要的功能，自從1997 年BR 受體BRI1被克隆鑒定之后，人們通過各種遺傳（如EMS 誘變、激活標簽和T-DNA 插入篩選等）和生化（如酵母雙雜交、雙向電泳等）手段對BRs 的信號轉導過程進行了廣泛且深入的研究［10］。2017 年Sun 等利用TILLING（Targeted Induced Local Lesions In Genomes）技術獲得了多個BRI1 突變體，并證實這些突變體中BRI1 不同位點的突變，對BR 信號通路有不同的影響，因此這些突變體的發現為BR 信號通路中早期事件的研究奠定了基礎［11］。

本研究利用CRISPR/Cas9 基因組編輯技術，在模式植物擬南芥Col-0 生態型中定向編輯BRs受體BRI1，以期獲得新的擬南芥BRI1 的突變體，為進一步闡釋BRI1 生物學的功能以及驗證其他物種中BRI1同源基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物及培養

野生型擬南芥Col-0，WS2 及BR 突變體bri1-5和bri1-701 均由蘭州大學黎家實驗室提供。植物材料培養，挑選飽滿度均一的擬南芥種子，在EP管中加無菌蒸餾水，4℃春化2～3 d，用移液器點播于營養土中，在溫室中22℃長日照培養（16 h光照/8 h 黑暗）。1/2 MS 固體培養基培養無菌的材料，在超凈臺用75%（v/v）滅菌1 min，用無菌ddH2O 清洗2～3 次，然后1%次氯酸鈉（v/v）滅菌15 min，再用無菌ddH2O清洗3～5次。用無菌槍頭點播于1%（w/v）蔗糖和0.8%（w/v）瓊脂的1/2 MS 固體培養基，在超凈臺吹干后用Prafilm 封口，倒置放于4℃冰箱春化3 d，然后放入培養箱，在22℃長日照培養（16 h 光照/8 h 黑暗）。下胚軸處理實驗，4℃春化后，22℃24 h持續暗培養。

1.1.2 菌株和質粒

本實驗所用的大腸桿菌菌株（DH5α）和根癌農桿菌菌株（GV3101），CRISPR/Cas 系統載體pCBC-DT1T2 和pHEE401 均由蘭州大學黎家實驗室提供。

1.1.3 試驗試劑

DNA 膠回收試劑盒、植物總RNA 提取試劑盒及質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技公司，DNA 聚合酶和反轉錄酶購自諾唯贊公司，限制性內切酶購自NEB 公司，TransStart?Top Green qPCR SuperMix 試劑盒購自TransGen Biotech 公司，DNA 提取試劑盒和2，4-表油菜素內酯購自生工生物工程（上海）公司，引物合成（見表3）及測序服務由北京華大公司提供。

1.1.4 數據處理方法

用SPSS 22.0 軟件統計分析，Image J 軟件測量根和下胚軸的長度，Photoshop CC 2019 軟件作圖。

1.2 實驗方法

1.2.1 sgRNA靶位點的選取

首先從擬南芥數據庫（https：//www.arabidopsis.org）中獲得AtBRI1 基因序列（AT4G39400）。并登陸CRISPR-PLANT 網站（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPR search.html）輸入目的基因序列，分析獲得含有PAM序列的潛在靶位點（見表1）。基于前期對BRI1 突變體的研究報道［11］，BRI1蛋白的N 端在植物信號感知中具有重要作用，我們初步選擇了一條位于BRI1 胞外區功能結構域的sgRNA 靶點序列（AGCTCCAAGCCTCTCAACGT-CGG）進行基因定向編輯。

表1 AtBRI1基因中sgRNA序列Table 1 sgRNA sequence in AtBRI1 gene

1.2.2 CRISPR/Cas9-AtBRI1載體構建

合成含靶點序列的引物DT1-BsF，DT1-F0，DT2-R 和DT2-BsR（見表3），以pCBC-DT1T2 為模板擴增獲得帶有目的序列的基因片段，并通過酶切連接構建表達載體CRISPRCas9-AtBRI1（見表2）。

表2 酶切—連接體系Table 2 Enzyme digestion-connection system

1.2.3 擬南芥的遺傳轉化與陽性株檢測

將載體CRISPR/Cas9-AtBRI1熱激轉入農桿菌（GV3101），通過花浸法轉入擬南芥，獲得的種子在含有40 mg·L-1潮霉素的1/2 MS 培養基篩選，獲得T0代陽性單株。挑選具有bri1 突變體類似表型的植株葉片DNA 用引物（AtBRI1-F，AtBRI1-R）擴增包含編輯位點的片段并測序。

1.2.4 實時熒光定量PCR

選取在1/2 MS 固體培養基生長10 d 的擬南芥幼苗，經1 μm·L-1BL 處理3 h 后提取植物總RNA，反轉錄合成cDNA 后，以Actin2 為內參，分別檢測各樣品中CPD，DWF4，BR6ox2 及SAUR-AC1 的表達量，以從分子水平上分析各樣品中的BR 信號響應是否受損。依據TransGen Biotech 公司Trans-Start?Top Green qPCR SuperMix 試劑盒用20 μL反應體系進行qPCR，每個樣品3 個重復。引物設計及檢測方法參考Wu等［12］。

1.2.5 BL處理根長和下胚軸的測量

在超凈臺上用75%酒精和1%次氯酸鈉消毒后的擬南芥種子，點播于添加1 μm·L-1BL 的1%（w/v）蔗糖和0.8%（w/v）瓊脂的1/2 MS 培養基上。4℃春化2～3 d，培養皿垂直放置于22℃恒溫培養箱進行長日照培養（16 h 光照/8 h 黑暗）。7～8 d 后拍照，用Image J 測量根長并進行統計處理。為了進行BL 對下胚軸敏感性試驗，將春化后的培養皿垂直放于22℃恒溫培養箱，進行24 h 連續暗培養，7～8 d后拍照，用Image J測量根長進行統計處理。

1.2.6 擬南芥鮮重測定

取生長在溫室中22℃長日照培養（16 h 光照/8 h 黑暗）30 d 幼苗進行稱重，并通過SPSS 22.0 軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1 CRISPR/Cas9-AtBRI1敲除突變體分子鑒定

在擬南芥AtBRI1基因序列239 bp的位置設計四個引物（DT1-BsF、DT1-F0、DT2-R 和DT2-BsR），通過酶切連接體系，該靶序列經退火復性插入到經BsaⅠ酶切的AtU6：sgRNA載體（見圖1）。

表3 PCR引物序列Table 3 PCR primer sequence

將構建好的帶有AtBRI1 基因靶序列的CRISPRCas9-AtBRI1 的農桿菌，通過pHEE401植物表達載體鑒定引物U626-IDF（TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC）和 U629-IDR（AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC）進行PCR 擴增，其條帶大小和預期片段大小相符，表明靶向敲除擬南芥AtBRI1 基因的CRISPR/Cas9 基因組編輯載體已構建成功（見圖2A）。為了驗證是否成功利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對野生型Col-0 中的BRI1 進行了靶向基因編輯，提取具有bri1 突變體類似表型的植株葉片DNA，用引物（AtBRI1-F，AtBRI1-R）擴增包含編輯位點的片段并測序（見圖2B）。對AtBRI1-F 和AtBRI1-R 擴增獲得的條帶進行測序分析，發現相比于野生型Col-0，不同的轉基因植株中均發現在Col-0 背景BRI1 254 bp 處插入了一個A（見圖3：A～C），導致原有序列提前終止（見圖3D），我們將通過CRISPR/Cas9 編輯產生的遺傳突變體命名為bri1-A。

2.2 AtBRI1突變體表型分析

因為CRISPR/Cas9-AtBRI1載體帶有潮霉素篩選標簽，所以在1/2 MS 培養基添加40 mg·L-1濃度的潮霉素篩選T0代轉基因植株，將抗潮霉素命名為bri1-A（見圖4A）；與Col-0 相比，bri1-A 突變體的植株矮小，顏色深綠，葉柄縮短，蓮座葉縮小變圓，角果縮短，雄蕊的花絲縮短導致成熟的花粉不能授到柱頭上造成雄性不育，bri1-A 突變體與bri1-5突變體相比為強突變體，植株表現的更加矮小，顏色深綠及葉柄縮短等表型。bri1-A 突變體的表型和BR 強突bri1-701 的表型類似，證明bri1-A突變體的表型可能是通過CRISPR 編輯造成了BR信號通路的嚴重阻斷，從而表現出BR 強突變體的類似的表型（見圖4C-D），鮮重統計分析表明，bri1-A和背景Col-0差異明顯，也遠遠低于BR弱突bri1-5，但比bri1-701 稍重，這和表型也相符（見圖4B）。

2.3 bri1-A對BL的敏感性分析

由于bri1-A 表現出類似于BR 缺失突變體類似的表型，為進一步驗證該表型是否是BR 信號通路受損相關，我們通過外源施加高濃度的BL 觀察該突變體對BL的敏感性。如圖5A和C所示，在用1 μm·L-1濃度的BL 處理時，野生型對照WS2 和Col-0 的根生長均受到明顯的抑制，而bri1-A 同bri1-5 和bri1-701 一樣，對BL 的敏感性降低。同時我們還觀察了在暗培養條件，如圖5B，D 所示，高濃度BL 處理對不同植物材料下胚軸伸長的影響，相比于野生型對照WS2和Col-0，在用1 μm·L-1濃度BL 處理后，bri1-A 同bri1-5 和bri1-701 一樣，BL 對幼苗下胚軸伸長的抑制明顯減弱。因此以上結果從生理層面證明bri1-A同BRI1的其他一些突變體一樣對BL 的敏感性降低，說明其產出的各種BR 缺失的表型與BR 信號通路的受阻息息相關。

為了從分子水平證明bri1-A 強烈的BR 突變體表型來自于通過CRISPR 編輯造成的BR 信號受損，我們采用實時熒光定量RT-PCR，檢測下游BR合成相關基因CPD，DWF4，BR6ox2，以及下游負反饋調節基因SAUR-AC1 的表達量，以驗證突變體中BR 信號通路是否正常［12～13］。如圖6 所示，在正常生產情況下，相比于野生型對照，BR 合成相關基因CPD，DWF4 和BR6ox2 在bri1-5、bri1-701 和bri1-A 中顯著上調表達，而負反饋調節基因SAUR-AC1 則顯著下調表達。當幼苗經過1 μm·L-1濃度的BL 處理后，在Col-0 和WS2 兩種野生型對照 中，CPD、DWF4 和BR6ox2 分 別 降 低78.6%/72.7%、80%/68.9%和87.9%/86.6%，而bri1-5、bri1-701 和bri1-A 僅分別降低4%/7%/14%、22.8%/8.8%/10%和24.4%/8.2%/21.0%，同時負反饋調節基因SAUR-AC1 在野生型對照植株中，經BL 處理后相比于正常植株顯著上調表達，而在bri1-5、bri1-701 和bri1-A 上調表達不顯著。因此以上結果從基因表達調控層面再次證明bri1-A 對BL 敏感性降低，且突變體中的BR 信號通路被阻斷。

3 討論

T-DNA 插入技術是我們早期研究基因功能常用的一種技術，Gang 等利用該技術甚至在白樺中鑒定到了由T-DNA 插入引起的突變體［14］。但對于特定靶基因的編輯，T-DNA 插入技術往往顯得有些捉襟見肘。雖然鋅指核酸內切酶（ZFNs）和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（TALENs）這兩種基因編輯技術可以實現定點靶向基因編輯［15～16］，但CRISPR/Cas9 技術在基因編輯中有著更為簡單快速的優點［17］，一方面CRISPR/Cas9 技術有較強的可操作性，可以通過Cas9 有目的敲除需要的靶點序列，另一方面，CRISPR/Cas9技術操作方便，且目的基因序列每8 個堿基就能找到一個進行編輯的PAM 序列［18］。基于這些優點，CRISPR/Cas9 技術已得到許多科研工作者認同，到目前為止，CRISPR/Cas9系統在醫學領域、植物科學領域以及動物科學領域被廣泛認可并成功研究應用。

在植物生長及發育過程中難免會遭受諸如病毒、細菌、真菌甚至昆蟲等的侵襲，所以植物在長期進化過程中形成了一系列的防御體系調控網絡，而植物激素就該調控網絡中扮演著重要角色。已有大量研究顯示，油菜素內酯作為一種植物激素除了調控植物的生長發育，也參與植物免疫防御反應［19～24］。因此定位于植物細胞膜上的油菜素內酯的受體BRI1，在植物生長、發育和免疫過程中起著很重要的調控作用［25～27］。但目前越來越多的研究顯示，BRI1 不同的位點或結構域在調控不同生物學的過程中起不同作用。所以為進一步了解BRI1 的功能，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術，構建多種新的BRI1突變體，對BRI1功能的深入理解必定起到積極的推動作用。在本研究中我們初步嘗試利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術，構建了一個新的BRI1 突變體bri1-A。如圖7 所示，其是由于一個堿基的插入突變，導致正常的BRI1 蛋白序列提前終止。由于現有BRI1 強突變體大多數為某些位點的替換，對某些特定結構域的功能研究產生不便。因此我們的初步嘗試為后續BRI1 功能的深入研究提供了參考。

綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術成功獲得了新的擬南芥BRI1 突變體，證明利用該技術獲得新的突變體就有一定可行性。同時對新突變體的深入研究，我們發現一些新的位點或者某些蛋白序列對基因功能的發揮至關重要，可能不同的位點以及特定的結構域在植物生長發育或植物對生物與非生物脅迫的響應中具有不同的調控作用。這就為今后深入研究特定基因的功能提供了重要遺傳基礎。由于BRI1 在不同物種中同源性相對較高，且發揮著類似的功能，所以利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術編輯其他物種中的BRI1，為后期分析其他物種中BRI1 的功能，甚至還可為優良作物品種的選育提供優質的種植資源，為推動綠色農業的發展提供動力。