耐冬山茶子葉再生體系的研究

田紅梅 郭 霄 王奎玲 孫迎坤

（青島農業大學園林與林學院，青島 266109）

耐冬山茶［Camellia japonica（Naidong）］為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）多年生常綠木本植物，主要分布于青島嶗山及附近島嶼，現有品種主要為野生資源的馴化衍生群體［1］。耐冬山茶花大嬌艷，具有極高的觀賞價值和園林應用價值，但其資源匱乏，生長緩慢［2］，傳統的繁殖方法周期長且繁殖系數較低，不能滿足市場的需求。而組織培養技術的日趨成熟為耐冬山茶加快品種繁育和品種創新提供了技術支撐。

在耐冬山茶組織培養方面，陳艷麗［3］以帶腋芽莖段及嫩葉為外植體，研究了莖段叢生芽誘導分化和葉片愈傷組織誘導分化的條件。董慧慧［4］以耐冬山茶的莖段，新葉及葉柄為外植體對耐冬山茶愈傷組織的誘導進行了研究。楊凱［5］對耐冬山茶的胚狀體和胚性愈傷組織的誘導進行了研究。吳斌［6～7］以耐冬山茶子葉為外植體，建立了耐冬山茶子葉愈傷組織途徑再生體系。

本研究以耐冬山茶的子葉為外植體，通過對耐冬山茶種子消毒、子葉愈傷組織增殖及不定芽較優激素配比的篩選、不定根的誘導條件的研究，成功建立了以耐冬山茶子葉為外植體的植株再生體系，以期為耐冬山茶的擴繁及后期外源基因的轉入提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

耐冬山茶的果實于2018 年9～10 月采自山東省青島市植物園。

所用的植物基本培養基MS 固體培養基與1/2MS 固體培養基，其pH 均為5.8。均經116℃滅菌30 min 后備用。MW 液體培養基為M&W 維生素溶液添加2%的蔗糖。實驗用椰汁為市場采購帶殼椰子，取椰汁后將椰汁pH 調至7.8，加熱后用濾紙過濾蛋白質［8］，經116℃滅菌30 min后備用。

外植體培養溫度均為25℃，光照強度為5 500 lx，光照時間為12 h·d-1。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐冬山茶外植體的處理及愈傷組織的誘導

果實處理：將果實剝去果皮，將種子用自來水沖洗干凈，放入滅好菌的培養瓶中，用75%的酒精浸泡10 s，然后用無菌水清洗2～3遍，瀝干水分，蓋上瓶蓋，放入超凈工作臺。在無菌環境下，用75%的酒精浸泡30 s，然后用無菌水清洗2～3 次，接著用2%的NaClo 浸泡5、8、10、15 min，無菌水清洗5～6遍，清洗完畢后將種子鋪在滅菌的濾紙上吸干表面的水分，備用。

用核桃鉗剝去種子外皮，去除種子內皮和胚芽，將子葉切成0.3～0.5 cm3的小塊接種于子葉誘導培養基MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12，4-D［7］，每瓶接種3 塊材料，每個處理組15 瓶，重復2 次，30 d后統計誘導率、污染率、干燥率。

1.2.2 耐冬山茶子葉愈傷組織的增殖

選取經過誘導后淡黃綠色，水潤，長勢良好的同一時期的子葉愈傷組織，切成0.3～0.5 cm3大小，接種前放到滅菌稱量紙上于天秤上進行稱重，稱量完后接種于附加不同激素的MS 培養基上，每瓶接種3 塊材料，每個處理組15 瓶，重復兩次，每30 d 轉接1 次，45 d 后稱量愈傷組織的質量，記錄其增殖倍數，同時觀察記錄愈傷組織的生長狀態。

1.2.3 耐冬山茶子葉愈傷組織不定芽的分化

選取經過兩次繼代培養后，水潤緊實、生長狀態良好的愈傷組織，放置于不同激素配比的不定芽分化培養基中，每瓶接種4 塊材料，每個處理組15瓶，每個處理組重復2次，每30 d轉接1次。2個月后，統計耐冬山茶愈傷組織不定芽的分化率。

不定芽基本培養基為MS 固體培養基附加50 mg·L-1椰 汁，0.5 g·L-1脯 氨 酸 以 及0.1 g·L-1谷 氨酰胺。

1.2.4 耐冬山茶子葉愈傷組織不定芽的生根誘導

總的來說，該算法占用資源少、處理速度快，尤其適用于在圖像目標的檢測場合中實現硬件加速，因此該算法不僅適用于在線紙病檢測系統，同時也適用于其他實時性較強的應用中，可以針對不同的應用場合靈活控制分塊的數量，完成對圖像目標的檢測和提取，以提高系統的實時性。

將成型后約2 cm 高的不定芽切取單芽，單芽基部用500 mg·L-1的IBA 處理70 min，然后轉接到不含任何激素的1/2MS 固體培養基和MW 液體培養基的濾紙橋上誘導生根。

每瓶接種1 株，每個處理組接種5 瓶，2 次重復。45 d后，統計不定芽的生根率。

1.3 統計指標

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對耐冬山茶愈傷組織誘導的影響

將耐冬山茶子葉接種到培養基約10 d，子葉開始變綠，部分子葉微微發紅（見圖1A），誘導15d左右出現愈傷組織，20 d 左右，愈傷組織呈現奶黃色，質地細密，基本覆滿整個切口（見圖1B），經過1個月的培養后，愈傷組織顆粒變大，呈淺黃綠色，顆粒狀明顯，愈傷組織基本能夠覆蓋整個子葉表面，且在子葉與培養基接觸的部位愈傷組織生長量最大（見圖1C）。

從圖2可以看出，愈傷組織的染菌率隨著消毒時間的延長整體呈下降趨勢。當消毒時間為8min時，愈傷組織的染菌率較低為14.3%，且此時愈傷組織的干燥程度較低，干燥率僅為21.4%。當消毒時間低于8 min 時，染菌率上升，消毒時間高于8 min 時，愈傷組織的干燥率整體呈上升趨勢。且愈傷組織的干燥率在消毒時間為15 min 時達到最高，可能是由于消毒時間過長對子葉產生了毒害作用。因此，長時間的消毒會對愈傷組織的生長狀態產生影響。

雖然耐冬山茶種子在經過2 %的NaClo 消毒5，8，10 與15 min 后，其愈傷組織的誘導率均為100%，但為了后期愈傷組織的繼代和不定芽的分化，我們將耐冬山茶種子的消毒時間定為8 min。

2.2 不同激素配比對耐冬山茶子葉愈傷組織增殖的影響

在不同激素配比的增殖培養基中，愈傷組織出現不同的生長狀態。生長良好的愈傷組織為黃綠色，比較水潤富有光澤（見圖3A）。同時，在增殖過程中有部分愈傷組織出現不均質顆粒（見圖3B），這與經過不定芽分化誘導的愈傷組織狀態相似。

從表2分析得出，愈傷組織在繼代培養過程中大致形成了以下幾種類型：Ⅰ.淺黃色，水潤，結構疏散；Ⅱ.黃綠色，微微發紅，水潤，質地緊實；Ⅲ.黃綠色，部分愈傷組織為淺紅色，呈瘤狀、不均質，質地緊實。在后期誘導分化過程中，Ⅰ型愈傷組織沒有分化出不定芽，Ⅱ型愈傷組織呈現不均質的瘤狀，質地緊實，分化出不定芽，Ⅲ型愈傷組織有不定芽的分化。

同時，從表2可以看出，在激素配比為0.4 mg·L-1NAA+1.5 mg·L-16-BA 與0.5 mg·L-1NAA+1.5 mg·L-16-BA中，愈傷組織增殖倍數較大，其增殖倍數分別為3.29與4.06，均屬于Ⅲ型愈傷組織。

2.3 不同激素配比對耐冬山茶愈傷組織不定芽分化的影響

將愈傷組織接種至不定芽分化培養基20 d 左右，愈傷組織出現不均質顆粒，水潤有光澤（見圖4A）。45 d 左右，愈傷組織變得緊實，顆粒狀更加明顯，同時分化出綠色的不定小芽（見圖4B），兩個月左右，小芽逐漸成形并在愈傷組織上分化出多個不定芽（見圖4C）。3 個月左右，不定芽芽條變得粗壯，長至約3 cm高（見圖4D）。

表2 不同激素配比對耐冬山茶子葉愈傷組織增殖的影響Table 2 Effects of different hormone combinations on cotyledon callus growth

通過統計叢生芽的誘導率和生長狀態（見表3）我們可以發現：生長素IBA 會導致愈傷組織呈現黑褐色，并不利于愈傷組織的分化；與IBA 相比，生長素NAA于更適于不定芽的誘導；而較高濃度的生長素更有利于不定芽的誘導。因此，適于愈傷組織不定芽分化的激素配比為1.0 mg·L-1NAA+10 mg·L-16-BA，叢生芽誘導率為10.7%。

2.4 耐冬山茶不定芽生根的誘導

通過實驗發現，使用較高濃度的IBA 處理不定芽基部一段時間后，莖段會變紅，膨大。與培養基接觸的莖段部分會長出淺黃色的愈傷組織顆粒。半個月左右，膨大變大的莖段上長出有白色絨毛的半透明狀的幼根（見圖5A），1 個月左右幼根伸長，呈半透明狀，微微發紅，有白色絨毛（見圖5B），2 個月左右，根逐漸粗壯，變成綠色（見圖5C）。

從表4可以看出，使用較高濃度生長素對不定芽基部進行處理后再將不定芽放入MW 液體培養基進行培養，一段時間后，不定芽莖段變紅、膨大，但并沒有幼根的產生，或許是由于不定芽基部與空氣接觸不足。在無任何激素的1/2MS 固體培養基中，不定芽莖段不僅變紅、膨大，而且在莖段部位還有少量愈傷組織的產生，根的誘導率為40%。

表3 不同激素配比對耐冬山茶愈傷組織不定芽分化的影響Table3 Effects of different hormone combinations on differentiation of C.japonica（Naidong）

表4 不同培養基種類對不定芽生根的影響Table 4 Effects of media types on differentiation of C.japonica（Naidong）

因此，1/2MS 固體更易于耐冬山茶不定芽的生根。

3 討論

3.1 外植體的選擇

選擇合適的外植體對于植物組織培養是十分重要的。木本植物組織培養所用的外植體，一般是該植物的幼年組織，如子葉和嫩莖等［9］。從20世紀80年代開始，國內外以山茶的子葉，莖尖與帶芽莖段等做為外植體成功獲得山茶再生植株。

在預備實驗中，使用耐冬山茶新葉及當年帶腋芽的莖段為外植體進行愈傷組織誘導，實驗結果發現葉片愈傷組織生長量小，生長緩慢，誘導愈傷組織過程中極易產生褐化，而莖段外植體的污染率和褐化率都較高。陳艷麗［3］在耐冬山茶葉片愈傷組織的不定芽誘導試驗中，并沒有獲得不定芽。董慧慧［4］在研究外植體種類對耐冬山茶愈傷組織誘導的影響實驗中發現，葉柄比莖段和葉片更容易產生愈傷組織，生長狀態最好。在本次實驗中，選用了耐冬山茶子葉作為外植體，經過愈傷組織、不定芽及不定根的誘導成功獲得了耐冬山茶的再生植株。

因此，外植體的選擇，不僅要考慮植物材料來源的豐富性、取材的難易程度以及后期材料保存的便利性，更重要的是考慮其分化能力的強弱。

3.2 耐冬山茶愈傷組織途徑的植株再生

在光照條件下，經2%次NaClo 滅菌8 min，在激素配比為0.5 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA［7］的MS 培養基中耐冬山茶子葉愈傷組織的誘導率為100%，染菌率為14.3%。而吳斌［7］在相同的激素配比下，經0.1%的HgCl 混合液浸泡8 min 后的耐冬山茶子葉愈傷組織的誘導率分別為88.89%和100%，平均誘導率為94.45%。所得到誘導率低于本實驗的誘導率，可能是因為選用了不同的消毒劑。

在繼代培養過程中，通過細化愈傷組織的增殖激素配比，獲得愈傷組織增殖的較優激素配比。同時，在子葉增殖實驗中，形成了3 種類型的愈傷組織，其中Ⅱ型與Ⅲ型愈傷組織更有利于后期不定芽的分化。

本次實驗中，通過研究不同激素配比對耐冬山茶子葉愈傷組織不定芽分化的影響，成功獲得了耐冬山茶子葉愈傷組織的不定芽，不定芽的獲得率為10.7%。愈傷組織不定芽誘導的成敗與多種因素有關，其中最為重要的是植物生長調節劑的種類和濃度［10］。研究表明，在誘導分化時需要添加較低濃度的生長素和較高濃度的細胞分裂素，從而使外植體內源生長素含量逐漸降低，內源細胞分裂素逐漸升高，以促進植物愈傷組織的分化［11］。在后續的實驗中，可以進一步細化NAA 和6-BA 的 濃 度，或 選 用 不 同 的 激 素 種 類KT［12～13］、TDZ［14～16］，或 不 同 的 培 養 基 種 類 如：WPM［10］、ER［17～18］、1/2ER［3］等。此外，也有研究表明，暗培養有利于不定芽的培養［19］，因此，后期也可以對外植體的培養條件進行改良優化，以提高不定芽的分化率。

木本植物在組織培養方面存在生根難等問題。而早在1997年，應承紀等［20］通過采用“浸沒—紙橋生根法”成功解決了云南山茶生根困難的問題，其生根率達80%以上。本次實驗參考“浸沒—紙橋生根法”，將不定芽芽條經高濃度生長素（500 mg·L-1的IBA）處理70 min 后在1/2MS 固體培養基中成功獲得不定根，根的誘導率為40%。而吳斌［7］在預備試驗中，直接使用含較低濃度NAA 或IBA的1/2MS 固體培養基誘導不定芽并未獲得生根苗。此次不定根的誘導試驗并未對生長素的浸沒時間以及培養條件進行深入的研究，在后期的試驗中，可以延長、細化生長素的浸沒時間或降低光照強度［21］以提高愈傷組織不定根的誘導率，從而建立更高效的再生體系。