超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品16種獸藥殘留量的研究*

陳鑫

（福州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建 福州 350025）

近年來，獸藥在養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)中的應(yīng)用日趨廣泛，但是，由于科學(xué)知識(shí)的缺乏和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，一些養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中存在超劑量、違禁、不遵守休藥期等使用獸藥的問題，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中獸藥殘留成為了日益突出的問題。目前，動(dòng)物源性食品中常見有抗病毒類、磺胺類、喹諾酮類、抗生素類、激素類、鎮(zhèn)靜劑等獸藥殘留，由于動(dòng)物源性食品種類繁多，樣品基質(zhì)復(fù)雜，檢測(cè)目標(biāo)物種類和組分多，理化性質(zhì)差異大，是獸藥殘留分析檢測(cè)技術(shù)的重大難題。我國(guó)測(cè)定動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1～3]大部分都是分類檢測(cè)為主，一個(gè)樣本要進(jìn)行多次檢驗(yàn)，需要耗費(fèi)極大的人為、物力、財(cái)力和時(shí)間。針對(duì)動(dòng)物源性食品獸藥殘留檢驗(yàn)任務(wù)繁重且時(shí)間緊迫的問題，研究快速、有效的分析檢測(cè)方法，提高提取和凈化效率，提高檢測(cè)靈敏度，建立高通量的多獸藥殘留分析方法是當(dāng)前獸藥檢測(cè)研究的方向。

本研究依據(jù)國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則（2020版）[4]動(dòng)物源性食品中喹諾酮類、磺胺類限用獸藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，結(jié)合抗病毒類禁用藥物，建立同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中抗病毒類、喹諾酮類、磺胺類（金剛烷胺、金剛乙胺、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶）16種禁限用獸藥殘留的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，為提高禁限用獸藥殘留檢測(cè)效率，保障食品安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品均為市售。

1.1.2 試劑及耗材

標(biāo)準(zhǔn)品（金剛烷胺、金剛乙胺：ChromaDEX公司；恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶：農(nóng)業(yè)部環(huán)科所）。

氘代內(nèi)標(biāo)（金剛烷胺D6、金剛乙胺D4 ：Cndisotopes公司；恩諾沙星D5、環(huán)丙沙星D8、諾氟沙星D5、磺胺間二甲氧嘧啶D6、磺胺鄰二甲氧嘧啶D3：農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心）。

凈化填料（C18、PSA：安捷倫科技有限公司；NH2、Florisil：Agela科技有限公司）。

試劑（水為超純水；甲醇、乙腈、乙酸銨、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器

1290 超高效液相+6460A質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司；

InertSustain C18 柱：2.1 mm×50 mm，2 μm，日本島津公司；

Eclipse XDB-C8 柱：2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

KQ3200B 型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；

N-EVAP氮吹濃縮儀：美國(guó)Organomation公司； GENIUS 3 旋渦混合器：德國(guó)IKA公司；

TDL-5-A 低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭電子儀器廠； AL204 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相條件

色譜柱：C18色譜柱，2.1 mm（內(nèi)徑）×50 mm，粒徑 2μm；流動(dòng)相：A，含0.1%甲酸的水溶液，B，乙腈。

柱溫： 35 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。 梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧ESI，正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；霧化氣、輔助氣、碰撞氣均為高純氮?dú)狻?/p>

使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求，監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞能以及碎裂電壓等主要質(zhì)譜參數(shù)見表2。

內(nèi)標(biāo)法定量，金剛烷胺以金剛烷胺D6為內(nèi)標(biāo)；金剛乙胺以金剛乙胺D4為內(nèi)標(biāo)；恩諾沙星以恩諾沙星D5為內(nèi)標(biāo)；環(huán)丙沙星以環(huán)丙沙星D8為內(nèi)標(biāo)；諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星以諾氟沙星D5為內(nèi)標(biāo)；磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉以磺胺間二甲氧嘧啶D6為內(nèi)標(biāo)；磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶以磺胺鄰二甲氧嘧啶D3為內(nèi)標(biāo)[2,3]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光-18 ℃下保存，有效期3個(gè)月。用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋，配成磺胺類、氟喹諾酮類濃度為1.0μg/mL，抗病毒類濃度為0.1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，避光-18 ℃下保存，有效期1個(gè)月。

表2 目標(biāo)化合物質(zhì)譜參數(shù)

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：分別取適量氘代內(nèi)標(biāo)，用甲醇分別配制成10.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，避光-18 ℃下保存，有效期3個(gè)月。用甲醇將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋，配成磺胺類、氟喹諾酮類濃度為1.0μg/mL，抗病毒類濃度為0.1 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，避光-18 ℃下保存，有效期1個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和同位素內(nèi)標(biāo)中間溶液，用甲醇配制成磺胺類、氟喹諾酮類濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL（混合同位素內(nèi)標(biāo)濃度為10.0 ng/mL)，抗病毒類濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL（混合同位素內(nèi)標(biāo)為1.0 ng/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，當(dāng)天配制。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

稱取約5.00 g（精確至0.01 g）的均勻試樣，置于50 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確加入混合內(nèi)標(biāo)工作液10μL，加入1 g氯化鈉，15 mL 1%甲酸-乙腈溶液（體積分?jǐn)?shù)），渦旋混合30 s，超聲提取10 min，4000 r/min離心5 min，收集上清液。剩余部分重新加入15 mL 1%甲酸乙腈，重復(fù)提取1次，合并2次提取有機(jī)相，待凈化。

凈化：將提取液移入含有100 mg C18填料和500 mg 無水硫酸鈉的試管中，渦旋提取30 s，吸取所有有機(jī)相溶液，50 ℃氮吹濃縮至近干，加入1.0 mL0.1%甲酸-25%乙腈水，渦旋混合溶解殘?jiān)?0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定[5,6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

圖1 色譜柱分離效果圖

對(duì)目標(biāo)化合物的質(zhì)譜及色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)物的定量離子色譜圖及質(zhì)譜參數(shù)結(jié)果見圖2和表2。比較了C18和C8色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果，C8色譜柱對(duì)目標(biāo)物的保留能力均較弱，峰形較寬，選用C18色譜柱作為分離色譜柱。比較了幾種不同流動(dòng)相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.01 mol/L乙酸銨、甲醇-0.01 mol/L乙酸銨），經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水相中含有甲酸時(shí)，能夠明顯提高色譜分離的效果；使用乙腈為有機(jī)相時(shí)，各化合物的峰形和靈敏度效果優(yōu)于甲醇，最終選用乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相，液相色譜梯度洗脫程序如表1所示，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜柱分離效果如圖1所示。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本研究選擇豬肉作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別用乙腈、1%甲酸-乙腈（體積分?jǐn)?shù)）、1%乙酸-乙腈（體積分?jǐn)?shù)）、1%氨水-乙腈（體積分?jǐn)?shù)）4種提取溶液，通過添加回收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1%甲酸-乙腈（體積分?jǐn)?shù)）提取溶液的提取效果優(yōu)于其它提取溶液，其回收率最好。因此，本研究選擇1%甲酸-乙腈體系作為提取溶液體系。

QuEChERs 凈化方法所使用的填料有PSA、C18、GCB、NH2和Florisil等，本研究首先考察了這幾種填料對(duì)目標(biāo)化合物的凈化效果，分別在標(biāo)準(zhǔn)工作液中加入50 mg填料，結(jié)果表明， GCB、NH2、Florisil對(duì)氟喹諾酮類化合物及磺胺氯噠嗪有不同程度上的吸附，PSA對(duì)磺胺氯噠嗪有吸附，只有C18吸附劑不干擾目標(biāo)化合物的響應(yīng)值。進(jìn)一步考察C18填料使用量，最終選擇C18 100 mg作為凈化吸附劑。

圖2 目標(biāo)化合物定量離子提取色譜圖

圖2 目標(biāo)化合物定量離子提取色譜圖（續(xù)）

2.3 定量方法選擇

基質(zhì)效應(yīng)影響主要是指基質(zhì)在電離源霧化電離過程中對(duì)目標(biāo)物的霧化電離產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)作用[7]。通常，去除基質(zhì)效應(yīng)的方法是配制基質(zhì)加標(biāo)曲線，但由于檢測(cè)樣品種類繁多，難以找到匹配基質(zhì)液。因此，本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)法，通過內(nèi)標(biāo)定量，降低樣品處理過程中基質(zhì)產(chǎn)生的影響。

分別考察了純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性、基質(zhì)空白加標(biāo)線性（將空白樣品按前處理方法提取凈化后，在提取液中添加目標(biāo)化合物配制成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線）、隨行加標(biāo)線性（空白樣品，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，與樣品同時(shí)進(jìn)行提取和凈化得到的線性），經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)：隨行加標(biāo)線性由于在提取和凈化過程中造成了損失，得到的線性不夠理想；純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性、基質(zhì)空白加標(biāo)線性由于內(nèi)標(biāo)校正作用，其線性及對(duì)目標(biāo)化合物的定量效果相當(dāng)，考慮到基質(zhì)空白加標(biāo)線性配制過程繁瑣，因此，采用純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性進(jìn)行定量，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

2.4 方法的檢出限、回收率和精密度

分別進(jìn)行了豬肉、豬肝、雞肉和雞肝樣品的基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以3倍信噪比，進(jìn)行檢出限的考察，綜合不同基質(zhì)的復(fù)雜性，得出抗病毒類藥物金剛烷胺和金剛乙胺的最低檢測(cè)限均為0.5μg/kg，磺胺類和氟喹諾酮類藥物的最低檢測(cè)限為1.0μg/kg。采用添加回收的方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，添加了3個(gè)不同水平，每個(gè)試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過表4和表5可知，本方法的回收率范圍為71.2%～119.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.8%～10%，能滿足獸藥殘留測(cè)定的要求。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)

表4 抗病毒類藥物回收率和精密度

表5 磺胺類和氟喹諾酮類藥物回收率和精密度

圖3 陽性樣品色譜圖

2.5 樣品檢測(cè)

采用所建立的方法測(cè)定了購(gòu)于超市及農(nóng)副產(chǎn)品市場(chǎng)樣品，測(cè)定雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品共計(jì)38份，所檢測(cè)樣品檢出2份恩諾沙星及1份氧氟沙星藥物殘留，陽性樣品色譜圖見圖3。

3 結(jié)論

本研究建立了動(dòng)物源性食品中16種禁限用獸藥殘留的分析方法，通過優(yōu)化液相色譜、質(zhì)譜條件，考察樣品前處理方法，內(nèi)標(biāo)法定量，建立了動(dòng)物源性食品中抗毒類、磺胺類和氟喹諾酮類16種獸藥殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，克服單一種類獸藥殘留檢驗(yàn)操作繁瑣的缺點(diǎn)，適用于多獸殘實(shí)際樣品的篩查和測(cè)定。