大量元素對桉樹組培生根的影響

王楚彪，李華強，樊林華，何文亮，羅建中，盧萬鴻，林彥

大量元素對桉樹組培生根的影響

王楚彪，李華強，樊林華，何文亮，羅建中，盧萬鴻，林彥

(1. 國家林業和草原局桉樹研究開發中心，廣東 湛江524022；2. 南京林業大學，江蘇 南京210037；3. 中林集團雷州林業局有限公司, 廣東 湛江524043)

選用大面積種植的桉樹優良無性系尾巨桉DH32-29的環割嫩芽為外植體，采用正交試驗設計進行組培生根實驗，探討不同大量元素對桉樹組培生根的影響。結果表明：(1)硝酸鉀對根條數、根長、莖高起到主效應作用，高濃度硝酸鉀在675 mg·L促進根條數的誘導，卻抑制根的生長，硝酸鉀濃度在405 mg·L達到莖高頂峰值；(2)既適合根誘導又保證根、莖質量的培養基中大量元素組合為硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、氯化鈣、硫酸鎂對應濃度分別為405、862.5、390、200、700 mg·L；(3)最適合根誘導的培養基中大量元素硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、氯化鈣、硫酸鎂對應濃度分別為675、345、390、120、280 mg·L；最適合根生長的大量元素濃度分別為270、862.5、260、200、700 mg·L；最適合莖生長的大量元素濃度分別為405、345、650、200、420 mg·L。研究結果有助于更清楚地認識大量元素對桉樹組培生根的影響，有助于提高桉樹組培的生根效果。

桉樹；組織培養；大量元素；正交設計

桉樹()是華南地區最主要的商品林樹種，在華南地區林業中占重要的地位。桉樹雜交種是利用不同品種桉樹作為親本，通過人工控制授粉培育而成。桉樹引種和推廣種植需要大量的雜交無性系，因此需要對雜交桉子代進行無性擴繁。無性繁殖包括組織培養，桉樹的芽培養是迄今為止應用最普遍的培養方法，桉樹組培既能規模化生產，又能夠保持親本的優良特性。尾巨桉()DH32-29是廣西東門林場以尾葉桉U16()為母本、巨桉G46()為父本雜交的優勢種，后經無性繁殖得到的優良桉樹品種。該無性系具有生長迅速、產量高、抗病性強、干行通直圓滿、自然整枝好等優點，在各地的種植試驗均表現出較強的適應性和良好的速生豐產性能。

前人對桉樹組培生根已經做過大量研究，大多數對生根培養基的處理是設立等梯度的植物生長調劑濃度，盧開成得出尾巨桉DH32-26最佳生根培養基是改良1/2 MS + IBA 0.2 mg·L+ ABT0.3 mg·L。楊衛星得出尾巨桉DH32-28最佳生根培養基是1/2 MS + IBA 0.3 mg·L+ ABT0.6 mg·L。然而盧娟等得出尾巨桉DH32-29最佳生根培養基是MS+NAA 1mg·L+ 6-BA 0.2 mg·L。梁秀莉以改良1/2 MS為基本培養基，對3個無性系DH32-26、DH32-28、DH32-29進行離體快繁研究，得出尾巨桉DH32-26最佳誘導生根植物生長調節劑組合為IBA 0.2 mg·L+ABT1.5 mg·L，DH32-28、DH32-29最佳誘導生根植物生長調節劑組合為IBA 0.2 mg·L+ ABT1 mg·L。盡管用的是相同的試驗材料，但得出結果卻不盡相同。而大量元素對尾巨桉生根的影響程度卻鮮有研究。陳明淵對尾巨桉DH33-27組培生根設立不等梯度濃度的大量元素進行單因素分析，得出大量元素濃度為1/2MS時，生根效果較好。大多數人在桉樹組培生根培養階段都使用1/2 MS或1/4 MS為基本培養基，因此本試驗基于1/2 MS培養基進行優化。

為了提高桉樹組培苗的質量，需要進行組培配方的試驗，而其中組培生根試驗是重要環節，在這一方面，用以往的常規MS培養基達不到高效的生產要求，為了進一步改良桉樹的培養基，本研究以尾巨桉DH32-29為對象，對所使用的生根培養基進行改良，以期提高桉樹組培生根的質量和效率。

1 材料與方法

1.1 材料

以廣西東門林場的優良無性系單株尾巨桉DH32-29經環割后萌發的枝條作為外植體，經過初代培養以及繼代增殖培養獲取大量增殖材料。

1.2 正交試驗因素水平的確定

傳統常規MS培養基中含有NH4成分，但是NH4濃度越高，就越抑制根的生長，濃度在0.3 g·L時苗木生長正常，NH4在生產應用過程中存在一些問題，生根周期間部分苗株的根系質量低、根系少，且一直不抽高，呈現淡黃色，此現象在夏季高溫天氣更嚴重。因此，本試驗用硝酸鈣代替硝酸銨。本研究采用正交設計對生根培養基的大量元素進行分析，以往的生根培養基的配制，僅調控總體大量元素的濃度，使用不等梯度100%、50%、40%、30%MS培養基進行試驗，而無法分析各個元素的主效應。通過正交試驗設計可得出各個元素的主效應，得到不同因素水平的最優組合，從而確定合理的試驗方案。分析生根率、根長、苗長三個指標，確定這3個指標受到哪種元素以及水平的影響，從而選擇出生產上所需要的方案。

在生產上使用的1/2 MS處理的基礎上，選擇不同濃度的硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、氯化鈣、硫酸鎂為考察因素，以根條數、最長根根長、莖高為考察指標，按L(4)進行正交試驗，16個處理因素水平安排見表1。

表1 正交因素水平表 mg·L-1

1.3 生根培養

待增殖芽苗長至2 cm以上時，切取帶頂芽莖段作為生根芽，接入正交設計的生根培養基中，每個處理重復30瓶，每瓶接10個芽。每個處理固定加入相同的植物生長調節劑、蔗糖等，置于溫室自然條件下進行培養。30 d后觀察生根情況，記錄根條數、根長、徑高3個生長指標。

1.4 數據統計

采用SPSS 19.0統計分析軟件對數據進行方差分析與顯著性分析。其中極差計算見公式1，生根率公式見公式2。

=K?K(1)

式中：K=同一列因素中水平的均值總和/水平的個數。

生根率=(根條數/接種個數)×100% (2)

2 結果與分析

2.1 生根實驗苗生長狀況

16組處理中，共512個苗瓶，生根率為30%的有161瓶，生根率大于50%的有26瓶；對照組生根率均值為29.0%，處理13生根率最大值為40.7%；處理4、6、7、11出現掉葉的現象；處理15試驗號生根條數離散程度較大、生根率不穩定。處理4根長均值最大，該處理根長最大值為5.5 cm，最小值為1.5 cm，同時離散程度較大。處理9莖高均值最大，該處理莖高最大值為4.6 cm，最小值為1.7 cm，同時離散程度較大(表2)。

表2 大量元素對組培生根的的正交實驗結果

注：不相同大寫字母表示<0.01；不相同小寫字母表示<0.05。

2.2 各處理對桉樹組培生根的影響分析

基于17(包括對照CK)個處理對根條數、根長、莖高進行單因素多重比較，不同培養基處理的根條數、根長、莖高存在顯著差異，根條數最高的為處理13(ABCDE)，與其他處理差異極顯著，根條數最低的為處理4(ABCDE)，同樣與其他處理差異極顯著，根條數對照處理與處理3、7、9、10、11差異達不到極顯著；根長最長的為處理4(ABCDE)，與處理6(ABCDE)無顯著性差異，根長對照組與其他處理差異極顯著；莖高最高的為處理9(ABCDE)，極顯著高于其他組合，莖高對照組與處理3、14差異極不顯著。

2.3 大量元素對桉樹組培生根的主效應分析

由極差分析可得(表2)，大量元素對尾巨桉DH32-29組培生根的根條數的影響順序為硝酸鉀>硝酸鈣>氯化鈣>磷酸二氫鉀>硫酸鎂。對應的K值顯示，根條數最優組合是ABCDE，即硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、氯化鈣、硫酸鎂濃度分別對應675、345、390、120、280 mg·L，此時生根條數最多。對同一因素不同水平進行兩兩比較，得出根條數所需的磷酸二氫鉀與硫酸鎂分別在各自的4個水平上表現差異不顯著，這表明，即使在最優組合下，也可以選擇B、E藥品的4個濃度。

大量元素對尾巨桉DH32-29組培生根根長的影響順序為硝酸鉀>磷酸二氫鉀>硝酸鈣>硫酸鎂>氯化鈣。根長最優組合是ABCDE，即硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、氯化鈣、硫酸鎂濃度分別對應270、862.5、260、200、700 mg·L，此組合有助于根的生長，在最優組合的基礎上，根長的硝酸鉀K、K差異不顯著，硫酸鎂在K、K、K水平上差異不顯著，可選擇A、E、E、E進行組合。

大量元素對尾巨桉DH32-29組培莖高生長的影響順序為硝酸鈣>硝酸鉀>氯化鈣>硫酸鎂>磷酸二氫鉀，即硝酸鈣起主要作用。莖高最優組合是ABCDE，即硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、氯化鈣、硫酸鎂濃度分別對應405、345、650、200、420 mg·L，此組合有助于莖的生長，在最優組合的基礎上，可把E替換成E；B替換成B、B、B。

由方差分析可得(表3)，硝酸鉀對根條數有顯著差異，其他因素對根條數無顯著影響。磷酸二氫鉀對莖高無顯著差異(>0.05)，如考慮節省藥品，可選擇B、B、B進行組合。根條數與根長各因素主次順序與極差分析一樣，不同的是，莖高因素的硝酸鉀大于硝酸鈣。

表3 大量元素對組培生根影響的方差分析

通過比較方差均值和生長狀況可知，處理13時，根條數達到最大，說明生根率高，但是根長受到了限制，使得根長在這16組處理數據中達到最低值，而濃度越高的硝酸鉀越不利于根的生長，卻利于生根，綜合三個指標，應優先選擇A；磷酸二氫鉀對生根無顯著影響，對根的生長有顯著影響，說明高濃度的磷酸二氫鉀有利于根的生長，而磷酸二氫鉀對苗莖高無顯著性差異，應優先選擇B；硝酸鈣對根長和莖高有顯著影響，濃度越高的硝酸鈣越有利于莖高的生長，不利于根長的生長，應選擇C；氯化鈣對根長和莖高有顯著影響，且倆者濃度越高都有促進的效應，應優先選擇D；硫酸鎂對根長有顯著性影響，應優先選擇E；結合上述分析，生產上要達到生根苗質量標準，應選擇ABCDE組合。

3 討論

3.1 影響生根率的因素

組培生根過程中，影響因素較多，導致生根情況不穩定，例如赤桉()對光照強度敏感，其他桉樹樹種可正常生長的光照條件，赤桉則表現出不適應性；大花序桉()組培生根則普遍表現困難，在生根性狀上，有較多的基因依賴性。本試驗尾巨桉DH32-29組培生根率除了受硝酸鉀影響可能還受到其他因素的影響，如受到含黃酮類生根抑制劑，或受到鐵鹽濃度的影響。達到最大的生根率同時避免生根條數的不穩定性是在生產應用中是仍需攻克的問題。此外，由于未對外源植物生長調節劑試驗，本試驗生根率結果較低。

3.2 硝態氮對組培生根的影響

KNO、Ca(NO)以硝態氮形式利用，濃度越高的KNO對生根率有促進作用，硝酸鉀隨著水平濃度上升，K值對應增加，但是硝酸鈣對根條數無顯著差異，在濃度第二水平時K值達到最大；濃度高的硝態氮對根長有抑制作用，硝酸鉀與硝酸鈣濃度越高，對根長的抑制越明顯。梁秀莉表明尾巨桉DH32-29組培生根培養基中KNO濃度越高，生根苗的根系變得越來越短，質量也越低，而且影響根的誘導。硝酸鈣濃度在260 ~ 650 mg·L，濃度上升，莖高均值增加；硝酸鉀濃度在405mg·L時，莖高達到峰值。高濃度的硝態氮抑制蘭科(Orchidaceae)、松科(Pinaceae)組培苗生長，所以在選擇硝態氮濃度上，既要提高生根率又要提升生根質量，需要結合指標配比進行試驗。

3.3 鈣離子對根生長的調節

本試驗根長與莖高Ca濃度上升，K值對應增加，但是Ca(NO)濃度上升，根長的K值減小，Ca(NO)濃度為650 mg·L時根長K為2.056，KNO濃度為675 mg·L時，根長K為1.626，說明硝態氮對根長的抑制效應大于Ca促進效應，兩者拮抗作用導致根長Ca(NO)的K大于KNO的K。范春節等研究表明不同硝酸鈣濃度對尾赤桉()不定芽分化具有一定影響，歐陽磊對鄧恩桉()生根培養基中大量元素配比進行優化，降低Cl的含量，提高Ca的含量，以減少愈傷組織的形成。對于桉樹生根鈣離子調控生長這方面鮮有研究。

3.4 生根培養的大量元素組合優化

對比各處理與大量元素主效應分析，根條數可選擇的最優組合ABCDE與根條數最高處理組合13(ABCDE)明顯區別是C硝酸鈣的選擇，硝酸鈣對根條數無顯著性差異，4個濃度的硝酸鈣均對生根根條影響不大。氯化鈣對根條數也無顯著性差異，證明Ca對生根根條數沒有影響，而硝酸鉀對生根率有影響。根長可選擇的最優組合ABCDE與根長最高處理組合4(ABCDE)明顯區別是C硝酸鈣的選擇，硝酸鈣對根長有顯著性差異，且低濃度的硝酸鈣利于根的質量，證明NO、Ca對生根根長有影響；莖高可選擇的最優組合ABCDE與莖高最高處理組合9(ABCDE)明顯區別是C硝酸鈣與A硝酸鉀的選擇，證明NO、Ca對莖高有影響。所以正交實驗能大大減小試驗次數，選擇更好的C硝酸鈣和A硝酸鉀濃度。

本試驗中，保證根條數、根長、莖高達到最優情況下，選擇ABCE組合不僅節省時間，且能達到生產苗的質量要求，但是生根率低，卻浪費了許多試驗材料。為了提高生根率，應使用以下步驟生根，即先在生根培養基進行根的誘導，然后轉到促根、莖生長的培養基進行營養生長。第一步使用根條數最優組合ABCDE，進行根的誘導，第二步根據苗的生長趨勢，選擇促根的生長(ABCDE)或者促莖生長(ABCDE)的培養基。

4 結論

桉樹組培生根培養基中，高濃度硝態氮影響根的誘導，低濃度硝態氮利于根的質量。硝酸鉀在根條數、莖高、根長這三方面起到主效應作用，硝酸鉀對根條數有顯著差異；硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、氯化鈣、硫酸鎂對根長有顯著差異；硝酸鉀、硝酸鈣、氯化鈣對莖高有顯著差異。最適合根的誘導培養基ABCDE，即硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鈣、氯化鈣、硫酸鎂濃度分別對應675、345、390、120、280 mg·L；最適合根的生長培養為ABCDE，對應濃度分別為270、862.5、260、200、700 mg·L。即適合根誘導又保證根、莖的質量培養基為ABCDE，對應濃度分別為405、862.5、390、200、700 mg·L。

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Effects of Nutrient Elements on Rooting ofin Tissue Culture

WANG Chubiao, LI Huaqiang, FAN Linhua, HE Wenliang, LUO Jianzhong, LU Wanhong, LIN Yan

(1.)

Ring cut buds of×clone DH32-29, an excellent clone planted in large areas, were selected as explants for this research trial. An orthogonal experiment was designed to conduct tissue culture rooting experiments to investigate the effects of various nutrient elements on the of rooting shoots of this clone in tissue culture. The results showed that: (1) potassium nitrate played a major role in the number of roots, root length and stem heigh, with higher concentrations of potassium nitrate promoting the number of roots, but inhibiting the growth of roots at 675 mg·L. The peak value of stem height was reached at 405mg·L. (2) The concentration of key elements in the medium suitable for root induction and ensuring the quality of roots and stems were potassium nitrate 405 mg·L, potassium dihydrogen phosphate 862.5 mg·L, calcium nitrate 390 mg·L, calcium chloride 200 mg·Land magnesium sulfate 700 mg·L. (3) The corresponding concentrations of potassium nitrate, potassium dihydrogen phosphate, calcium nitrate, calcium chloride and magnesium sulfate in the optimal medium for root induction were 675, 345, 390, 120 and 280 mg·L, respectively. The best concentrations of elements for root growth were 270, 862.5, 260, 200 and 700 mg·L, respectively. The most suitable concentrations of elementsfor stem growth were 405, 345, 650, 200 and 420 mg·L, respectively. Results from this study provide a clearer understanding of the effects of key elements on the rooting of tissue culture ofand will help improve the growth of such tissue cultures.

; tissue culture; nutrient elements; orthogonal design

S722.3+7

A

10.13987/j.cnki.askj.2021.01.008

廣東省林業科技創新項目(2017KJCX031，2019KJCX014)

王楚彪(1982— )，男，助理研究員，從事林木遺傳育種研究，E-mail:scauwcb@163.com

林彥(1977— )，女，高級工程師，從事林木組培研究，E-mail:liny10000@126.com