難治性肺炎支原體肺炎患兒鼻咽抽吸物肺炎支原體DNA載量與其臨床癥狀的相關(guān)性

呂亞洲 耿巧玲 楊 紅

肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)是兒童呼吸道感染，尤其是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體之一，兒童肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)的發(fā)病率約占社區(qū)獲得性肺炎的10%～30%，其中18%需要住院治療。MPP可發(fā)生于兒童的各年齡段，主要臨床表現(xiàn)為高熱、氣促、持續(xù)性咳嗽，常伴有肺外系統(tǒng)損害，MPP是具有一定自限性的疾病，多數(shù)患兒可自行緩解，但部分患兒應(yīng)用大環(huán)內(nèi)脂類抗生素治療后仍高熱難退，臨床和影像學(xué)表現(xiàn)加重，導(dǎo)致閉塞性細(xì)支氣管炎、單側(cè)透明肺、支氣管擴(kuò)張、壞死性肺炎等肺部后遺癥，即難治性肺炎支原體肺炎(refractory mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP)。RMPP的嚴(yán)重程度受MP毒力、耐藥性、感染負(fù)荷、宿主的免疫力等因素影響，局部MP載量可客觀反映MP與宿主免疫力之間的關(guān)系，故RMPP局部MP載量可能與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，但檢測肺泡灌洗液操作具有創(chuàng)傷性，如果可以用鼻抽吸物代替，可有效提升患兒診療耐受能力。本研究對84例RMPP住院患兒進(jìn)行鼻咽抽吸物MP-DNA檢測，旨在探討其表達(dá)水平與MPP臨床表現(xiàn)的相關(guān)性及對RMPP的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年3月南陽市中心醫(yī)院收治的84例RMPP患兒為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡3個月～12歲；②符合《諸福棠實用兒科學(xué)》中MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)；③持續(xù)性發(fā)熱、咳嗽，肺部聽診可聞及濕性啰音；④X線胸片顯示肺部有浸潤影；⑤鼻咽抽吸物MP-DNA檢測陽性(MP-DNA拷貝數(shù)>400/mL)⑥應(yīng)用大環(huán)內(nèi)脂類藥物治療至少7 d，仍持續(xù)發(fā)熱(≥38.5℃)，臨床和影像學(xué)表現(xiàn)繼續(xù)加重的MPP。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它細(xì)菌或病毒感染；②原發(fā)性免疫功能缺陷者；③合并支氣管肺發(fā)育不良、支氣管哮喘、肺結(jié)核等其他肺部疾??；④合并腎臟、肝臟、心臟疾病；⑤合并腫瘤或其他系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，獲得患兒家長的知情同意并簽署知情同意書。入組患兒年齡3個月～12歲，平均(6.19±1.47)歲，其中男性53例，女性31例。根據(jù)鼻咽抽吸物中MP-DNA拷貝數(shù)，將患兒分為3組，拷貝數(shù)<10/mL的17例患兒為低表達(dá)組，拷貝數(shù)10/mL～10/mL的39例患兒為中表達(dá)組，拷貝數(shù)>10/mL的28例患兒為高表達(dá)組。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 所有患兒入院次日由經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的護(hù)士進(jìn)行標(biāo)本采集，清潔鼻腔后，將一次性無菌吸痰管自鼻孔伸入約7～8 cm至咽喉部，用無菌負(fù)壓吸痰器吸引鼻咽抽吸物約2 mL?；純喝朐捍稳招兄夤芊闻莨嘞葱g(shù)，回收第一次灌洗液，用雙層無菌紗布過濾，然后3 500 r/min離心10 min，留取上清液，分裝后存于-80℃冰箱待檢。

1.2.2 MP-DNA定量檢測 采用熒光實時定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)進(jìn)行MP-DNA定量檢測，試劑盒購于廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，應(yīng)用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems) StepOnePlus定量PCR儀。①標(biāo)本處理：將采集的鼻炎抽吸物標(biāo)本置渦旋震蕩器上，震蕩2 min，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，留取沉淀。②DNA提?。合虺恋碇屑尤?0 μL核酸提取液B，充分混勻，100℃裂解10 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液4 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物由上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)，上游序列為5'-FAAAGGATCCGGCAGAAATGCGTTGTAG-3'，下游序列為5'-AAAACTGCAGAACAATACCGAACTGACAGAA-3'。③PCR擴(kuò)增：將試劑盒中的MP-PCR MIX、Taq酶系于室溫下融化，震蕩2 min，充分混勻，3 500 r/min離心30 s，按照試劑盒要求完成每個測試反應(yīng)體系配制，PCR循環(huán)條件：94℃ 2 min，93℃ 30 s，55℃ 45 s，40個循環(huán)；94℃ 2 min，93℃ 30 s，56℃ 45 s，40個循環(huán)。④結(jié)果判定：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)，記錄儀器自動分析計算出的未知標(biāo)本數(shù)值(Qty-Copies/mL)，若Ct值<38，則樣品MP-DNA含量(基因拷貝數(shù)/mL)=Qty-Copies/mL；若38

1.3 觀察指標(biāo) 記錄3組患兒年齡、性別、發(fā)病至樣本采集時間、入院前β-內(nèi)酰胺類使用率、入院前大環(huán)內(nèi)酯類使用率、住院時間、臨床表現(xiàn)、實驗室和肺部影像學(xué)檢查結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 3組患兒一般情況比較 3組患兒入院前使用β-內(nèi)酰胺類66例(78.57%)，入院前使用大環(huán)內(nèi)酯類42例(50.00%)。3組患兒年齡、性別、發(fā)病至樣本采集時間、入院前β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類使用率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)，高表達(dá)組患兒住院時間長于中、低表達(dá)組(

P

<0.05)。見表1。

表1 3組患兒一般情況比較

2.2 3組患兒臨床表現(xiàn)比較 84例患兒中體溫>39℃ 57例(67.86%)，熱程≥10 d 37例(44.05%)，氣促37例(44.05%)，喘息14例(16.67%)，發(fā)紺35例(41.67%)，呼吸困難8例(9.52%)，呼吸衰竭6例(7.14%)，肺部濕啰音50例(59.52%)，肺部呼吸音減低18例(21.43%)，肺部哮鳴音10例(11.90%)。3組患兒總熱程、使用大環(huán)內(nèi)脂類后熱程、熱程≥10 d及體溫>39℃的比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；高表達(dá)組患兒總熱程、使用大環(huán)內(nèi)脂類后熱程長于中、低表達(dá)組(

P

<0.05)，高表達(dá)組患兒熱程≥10 d及體溫>39℃的比例較高；3組患兒氣促、喘息、發(fā)紺、呼吸困難、呼吸衰竭、肺部濕羅音、肺部呼吸音減低及肺部哮鳴音的比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見表2。2.3 3組患兒實驗室檢查結(jié)果比較 3組患兒淋巴細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、乳酸脫氫酶比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；3組患兒白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比及血紅蛋白比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見表3。

表2 3組患兒臨床表現(xiàn)比較

表3 3組患兒實驗室檢查結(jié)果比較

2.4 3組患兒肺部影像學(xué)檢查結(jié)果比較 84例患兒中單側(cè)肺病變33例(39.29%)，雙側(cè)肺病變51例(60.71%)，大片肺實變或肺不張23例(27.38%)，雙側(cè)或大量胸腔積液21例(25.00%)；3組患兒大片肺實變或肺不張、雙側(cè)或大量胸腔積液發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，其中低表達(dá)組患兒的發(fā)生率較低。見表4。

表4 3組患兒肺部影像學(xué)檢查結(jié)果比較[例(%)]

2.5 3組患兒肺泡灌洗液IL-4、IL-8、IFN-γ、TNF-α水平比較 3組患兒肺泡灌洗液IL-4水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，其中低表達(dá)組最低，高表達(dá)組最高；3組患兒肺泡灌洗液IL-8、IFN-γ、TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見表5。2.6 MP-DNA與肺泡灌洗液IL-4、IL-8、IFN-γ、TNF-α的相關(guān)性 三組患兒鼻炎抽吸物MP-DNA載量分別為(18.95±9.27)Copies/mL、(4.72±1.98)Copies/mL和(4.03±1.65)Copies/mL，相關(guān)性分析顯示MP-DNA水平與肺泡灌洗液IL-4呈正相關(guān)(

r

=0.481，

P

<0.001)，與IL-8、IFN-γ、TNF-α無相關(guān)性(

r

=0.055、0.042、0.069，

P

=0.429、0.476、0.413)。見圖1。

表5 3組患兒肺泡灌洗液IL-4、IL-8、IFN-γ、TNF-α水平比較

3 討論

MP是一種介于病毒與細(xì)菌之間，缺乏細(xì)胞壁，可獨立存活的最小病原微生物，其以氣溶膠的形式進(jìn)入呼吸道，依賴P1蛋白粘附在宿主氣道上皮細(xì)胞表面，將局部代謝產(chǎn)生的過氧化氫等物質(zhì)排入細(xì)胞內(nèi)，氧超載破壞細(xì)胞內(nèi)觸酶的活性，造成纖毛破壞、脫落、細(xì)胞腫脹、壞死凋亡，而氣道上皮細(xì)胞壞死可引起局部的炎癥反應(yīng)。機(jī)體的炎癥反應(yīng)可清除病原體，起保護(hù)作用；同時，過度免疫炎癥反應(yīng)可引起免疫損傷而加重病情，因此，直接侵襲和過度免疫炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是MP感染的主要致病機(jī)制。與成人相比，兒童的免疫力和抵抗力相對較差，MP感染發(fā)生率較高，MP感染除引起呼吸系統(tǒng)疾病外，還可會對其他系統(tǒng)和器官造成免疫損傷，增加治療難度，危害兒童的身心健康。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，其逐漸被應(yīng)用于MPP的診斷，既往呼吸道分泌物MP檢測陽性只能反映正常定植菌，不能代表侵襲致病菌，而鼻咽抽吸物MP-DNA檢測可真實反映呼吸道內(nèi)MP感染數(shù)量。RMPP的發(fā)病機(jī)制至今尚無定論，以往多支持MP的吸附作用和直接侵入發(fā)病等學(xué)說，但更多的學(xué)者認(rèn)為，RMPP可能與免疫炎癥損傷、MP載量、MP耐藥、MP分型、纖毛結(jié)構(gòu)破壞等有關(guān)。

目前研究表明，MPP病情嚴(yán)重程度與MP感染負(fù)荷呈正相關(guān)，MP-DNA拷貝數(shù)定量檢測是反映MP感染負(fù)荷常用的實驗室檢查方法。本研究對84例住院MPP患兒進(jìn)行了鼻咽抽吸物MP-DNA定量檢測，發(fā)現(xiàn)體溫>39℃ 57例，熱程≥10 d 37例，氣促37例，喘息14例，發(fā)紺35例，呼吸困難8例，呼吸衰竭6例，肺部濕羅音50例，肺部呼吸音減低18例，肺部哮鳴音10例；高表達(dá)組患兒住院時間、總熱程、使用大環(huán)內(nèi)脂類后熱程長于中、低表達(dá)組，高表達(dá)組患兒熱程≥10 d及體溫>39℃的比例較高；提示MPP患兒MP感染數(shù)量越多，臨床癥狀可能越嚴(yán)重，住院時間越長，即MPP病情輕重可能與呼吸道分泌物MP載量有關(guān)，與袁紅霞等報道結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，高表達(dá)組患兒淋巴細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、血小板計數(shù)較低，中性粒細(xì)胞計數(shù)、乳酸脫氫酶較高，低、中、高表達(dá)組C反應(yīng)蛋白水平呈升高趨勢；說明MPP患兒炎癥反應(yīng)與MP感染數(shù)量有關(guān)，MP-DNA拷貝數(shù)越高，炎癥反應(yīng)越強。其可能原因：MP感染數(shù)量越多，MP感染造成的呼吸道直接損傷越重，從而引起強烈的炎癥反應(yīng)，因此，建議臨床早期應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素或環(huán)丙沙星以控制MP感染，改善病情；除直接損害外，MP相關(guān)抗原能激活宿主免疫細(xì)胞，刺激驗證機(jī)制的釋放，MP感染數(shù)量越多，MP相關(guān)抗原表達(dá)量越多，引起的免疫炎癥反應(yīng)越強。肺部影像學(xué)檢查結(jié)果顯示，單側(cè)肺病變33例(39.29%)，雙側(cè)肺病變51例(60.71%)，大片肺實變或肺不張23例(27.38%)，雙側(cè)或大量胸腔積液21例(25.00%)；高表達(dá)組患兒大片肺實變或肺不張、雙側(cè)或大量胸腔積液發(fā)生率較高；說明高表達(dá)組患兒肺部損傷較低、中表達(dá)組更嚴(yán)重。

本研究還發(fā)現(xiàn)，患兒鼻炎抽吸物MP-DNA表達(dá)水平與肺泡灌洗液IL-4呈正相關(guān)，與IL-8、IFN-γ、TNF-α無相關(guān)性；提示MP-DNA表達(dá)水平可能與MMP患兒Th1/Th2免疫應(yīng)答有關(guān)，MP-DNA高表達(dá)可導(dǎo)致Th1/Th2偏移。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體感染后的細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用，其可活化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞以清除MP，并促進(jìn)細(xì)胞毒性NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞發(fā)揮抗感染作用。IL-4主要由活化的肥大細(xì)胞和Th2細(xì)胞產(chǎn)生，主要介導(dǎo)體液免疫，還參與Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡。高表達(dá)組患兒肺泡灌洗液中IL-4水平明顯高于低、中表達(dá)組，提示高表達(dá)組患兒Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡更嚴(yán)重，Th2型細(xì)胞因子更占優(yōu)勢。

綜上所述，MP-DNA表達(dá)水平與MPP住院患兒的臨床表現(xiàn)、Th1/Th2免疫應(yīng)答有一定的相關(guān)性，MP-DNA高表達(dá)患兒肺部炎癥和肺內(nèi)外損害可能更為嚴(yán)重，Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡，建議對MPP患兒進(jìn)行MP-DNA定量檢測，為病情診斷和臨床治療提供參考依據(jù)。