子癇前期孕婦血漿外泌體中LncRNA MALAT1和miR-206的表達水平及臨床意義

葉 青 翟桂榮 吳 允 楊慧麗

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種在妊娠期發生的以妊娠20周后出現高血壓和蛋白尿為主要特征的血管性疾病，發病率約4%～8%，可導致胎兒宮內生長受限和宮內窒息，是威脅孕婦和新生兒健康和生命安全的主要原因之一。因此，PE的早期診斷對降低孕婦與新生兒病死率、提高母嬰健康有重要意義。研究表明，滋養細胞侵襲能力不足、炎癥反應和血管內皮功能障礙是PE發生的主要機制。有研究發現，長鏈非編碼RNA肺腺癌轉移相關轉錄本1(Long non-coding RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，LncRNA MALAT1)在PE患者胎盤中表達下調，可能在調節滋養細胞增殖、細胞周期、凋亡、遷移和侵襲等方面發揮重要作用。急性冠脈綜合癥患者血漿微小RNA-206(microRNA-206，miR-206)表達水平上調，與血管內皮功能障礙引起的動脈粥樣硬化相關。外泌體是一種具有磷脂雙分子層的胞外囊泡，包含多種生物活性分子，在細胞間信號轉導、生物進程調控等方面意義重大。LncRNA MALAT1與miR-206在腫瘤血管生成和炎癥反應調控中被證實存在靶向關系，但其在PE患者外泌體中表達水平及作用機制鮮有研究，另血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)已被證實與PE進展密切相關。本研究擬通過檢測PE患者血漿外泌體中LncRNA MALAT1、miR-206表達水平，探究LncRNAMALAT1、miR-206對PE的診斷價值，以期為探討PE發生相關機制及臨床評估PE進展提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年12月在鄭州市婦幼保健院住院分娩的PE孕婦42例為研究對象(PE組)，另選取同期在本院分娩的健康孕婦42例為對照組。納入標準：①PE患者符合《婦產科學》中關于PE的診斷標準；②單胎妊娠者；③臨床資料完整。排除標準：①合并糖尿病、腎病、甲狀腺疾病等內分泌系統疾??；②孕期有特殊用藥史者；③合并精神疾病者。根據入組PE患者病情嚴重程度分為輕度組22例，重度組20例。收集所有研究對象入院時年齡、孕周、孕前身體質量指數(body mass inedx，BMI)、孕次、產次及收縮壓、舒張壓、24 h蛋白尿、血肌酐(Serum creatinine，Scr)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine transaminase，ALT)水平等一般資料。本研究經院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 血漿樣本采集及外泌體提取 分別收集PE患者入院時及健康孕婦體檢時清晨空腹外周血5 mL置于EDTA采血管中，離心分離血漿。使用外泌體提取試劑盒(貨號：76064，德國Qiagen公司)提取血漿外泌體。參照試劑盒說明，將所得血漿中加入100 μL提取劑于4℃環境下過夜，過夜后再離心、棄上清，重復2次，最后使用100 μL的磷酸鹽緩沖液重懸，得到外泌體。

1.2.2 血漿外泌體形態鑒定 使用透射電子顯微鏡(型號：HT7800，日本日立公司)觀察血漿外泌體形態。取20 μL外泌體重懸液于銅網上靜置5～10 min，濾紙吸干外圍液體后滴加4%磷鎢酸溶液染色10 min，染色完成后于燈下烤干，復染1次后使用透射電子顯微鏡觀察、拍照。透射電鏡下橢圓形/圓形的雙層膜囊狀結構為外泌體。

1.2.3 血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF mRNA表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術檢測血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF mRNA表達水平。Trizol法提取總RNA，用反轉錄試劑盒(貨號：205311，德國Qiagen公司)反轉錄為cDNA，用于qRT-PCR反應。使用qRT-PCR試劑盒(批號：RR041A，日本TaKaRa公司)進行實驗，20 μL反應體系如下：10 μL SYBRPrimix Ex Taq，0.4 μL ROX，2 μL cDNA，2 μL上游引物，2 μL下游引物，3.6 μL DEPC水。反應程序如下：95℃、8 min，1個循環；95℃、15 s，62℃、38 s，73℃、15 s，40個循環，一個樣品設置三次重復。采用2法計算血漿外泌體LncRNA MALAT1(以GAPDH為內參)、miR-206(以U6為內參)、VEGF mRNA(以GAPDH為內參)表達水平，試驗所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 3組一般資料比較 3組年齡、取樣孕周、孕前BMI、孕次、產次比較，差異均無統計學意義(

P

>0.05)。對照組、輕度組、重度組收縮壓、舒張壓、24 h蛋白尿、Scr、ALT依次升高，新生兒體質量依次降低，組間比較差異均有統計學意義(

P

<0.05)；重度組孕婦分娩孕周明顯短于輕度組和對照組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 3組一般資料比較

2.2 血漿外泌體透射電鏡形態鑒定 透射電鏡下血漿外泌體呈圓或橢圓形，具有雙層磷脂包圍的囊泡樣結構，單個分布，直徑約100 nm。見圖1。

圖1 血漿外泌體透射電鏡圖(67 000倍)

2.3 3組血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF表達水平比較 重度組和輕度組孕婦血漿外泌體LncRNA MALAT1、VEGF表達水平明顯低于對照組，miR-206表達水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)；重度組LncRNA MALAT1、VEGF明顯低于輕度組，miR-206明顯高于輕度組，差異均有統計學意義(

P

<0.05)。見表3。

表3 3組血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF表達水平比較

2.4 LncRNA MALAT1、miR-206和VEGF的相關性 LncRNA MALAT1與miR-206呈負相關(

r

=-0.570，

P

<0.05)，與VEGF呈正相關(

r

=0.374，

P

<0.05)，miR-206與VEGF呈負相關(

r

=-0.501，

P

<0.05)。見圖2～4。

圖2 LncRNA MALAT1與miR-206的相關性

圖3 LncRNA MALAT1與VEGF的相關性

圖4 miR-206與VEGF的相關性

2.5 PE發生的影響因素分析 以本研究資料為樣本，以年齡、孕周、孕前BMI、孕次、產次、收縮壓、舒張壓、24 h蛋白尿、Scr、ALT、LncRNA MALAT1、miR-206、VEGF為自變量，以PE是否發生為因變量建立logistic回歸模型，選擇逐步向前法，行LR檢驗。結果顯示，高舒張壓、24 h蛋白尿、miR-206水平及低LncRNA MALAT1、VEGF水平是PE發生的獨立危險因素(

P

<0.05)。見表5。

表4 單因素分析結果

表5 多因素logistic回歸分析結果

2.6 LncRNA MALAT1、miR-206對PE發生的預測價值 以受試者血漿外泌體LncRNA MALAT1、miR-206檢測值及兩者聯合預測概率值為檢驗變量，以PE是否發生為因變量進行ROC曲線分析，結果顯示，LncRNA MALAT1預測PE發生的曲線下面積為0.726(95%CI：0.613～0.840)，當截斷值為0.84時，其敏感度為73.81%、特異度為71.43%。miR-206預測PE發生的曲線下面積為0.748(95%CI：0.639～0.858)，當截斷值取1.85時，其敏感度為70.67%、特異度為83.33%。此二者聯合預測PE發生的曲線下面積為0.872(95%CI：0.781～0.935)，敏感度為92.86%、特異度為80.95%。見圖5。

圖5 LncRNA MALAT1、miR-206單獨及聯合預測PE發生的ROC曲線

3 討論

PE患者胎盤易出現缺氧缺血，導致胎兒宮內生長受限，可增加多種母嬰并發癥及母嬰死亡發生率，探究PE進展中相關因子的變化對評估PE發生，及時控制患者病情有重要意義。研究報道，胎盤形成時滋養細胞對子宮肌層的侵襲能力不足易造成子宮螺旋動脈重塑障礙及胎盤淺著床，進而導致孕晚期時胎盤灌注低、炎癥反應增加和血管內皮功能形成障礙，最終導致PE發生。

外泌體是一種由紅細胞、血小板、淋巴細胞等細胞分泌的囊泡，分布于生物體細胞、體液和胎盤中，可參與細胞間信號傳導，與胎盤功能紊亂有關。本研究結果顯示，血漿外泌體LncRNA MALAT1表達水平由高到低依次為對照組、輕度組、重度組，與Li等研究LncRNA MALAT1在早發性子癇患者胎盤組織中呈低表達結果相似，提示血漿外泌體LncRNA MALAT1低表達可能參與PE發生、發展。相關研究發現，LncRNA MALAT1水平降低時，可通過誘導上皮-間質轉化引起滋養細胞侵襲、遷移能力減弱和血管生成減少，導致子宮螺旋動脈重構損傷加重。本研究發現，PE孕婦血漿外泌體中LncRNA MALAT1與VEGF表達水平呈正相關，提示血漿外泌體中LncRNA MALAT1水平的下調可能是通過調控VEGF表達進而抑制血管生成，促進PE進展。但本研究納入樣本量較少，為驗證血漿外泌體LncRNA MALAT1與VEGF表達水平在PE中的作用，有待增加樣本量進行深入研究。

微小RNA多存在于外泌體中，其水平變化參與調控多種生物學進程。研究發現，PE患者胎盤組織和滋養細胞中miR-206表達水平上調。本研究結果顯示，重度組血漿外泌體miR-206表達水平最高，其次為輕度組，對照組最低，與Akehurst等研究結果一致，提示miR-206高表達可能預示PE發生。研究發現，VEGF可促進絨毛膜滋養層細胞的侵襲能力和血管生成；而過表達miR-206可減少外泌體產生，抑制血管平滑肌細胞增殖，進而抑制血管生長。本研究中，血漿外泌體中miR-206與VEGF表達水平呈負相關，提示血漿外泌體中miR-206與VEGF間可能存在調控作用，此結果與Li等研究血漿miR-206水平上調可通過下調VEGF表達，進而導致胎兒生長發育遲緩結果類似。提示血漿外泌體miR-206表達可能通過靶向調節VEGF水平影響胎盤血管生成，進而參與PE進展，此結果尚需增加樣本量進行驗證。

研究發現，血管瘤組織中LncRNA MALAT1、VEGF均呈高表達，而miR-206呈低表達，過表達LncRNA MALAT1可靶向抑制miR-206表達，進而上調VEGF水平，促進血管瘤內皮細胞增殖、遷移、侵襲及血管生成。本研究多因素logistic回歸分析發現，高miR-206水平及低LncRNA MALAT1水平是影響PE發生的危險因素，且兩者聯合預測PE發生的價值高于兩者單獨預測，提示臨床應關注血漿外泌體LncRNA MALAT1及miR-206表達的變化，以期能更準確的評估PE發生及進展。

綜上所述，PE患者血漿外泌體中LncRNA MALAT1呈低表達、miR-206呈高表達，兩者均是PE發生的危險因素，二者聯合檢測對PE的診斷價值高于兩者單獨檢測。但由于LncRNA MALAT1與miR-206作用機制復雜，本研究僅從VEGF入手推測，相關作用機制還需進一步進行基礎實驗以驗證。