羅格列酮對肺成纖維細胞增殖的影響

史方海陳忠仁

(海口市人民醫院呼吸內科,海口 570208)

肺纖維化是肺慢性炎癥的主要危害,例如慢性阻塞性肺疾病或哮喘,氣道慢性炎癥促使局部大量的促纖維化生長因子分泌[1],成纖維細胞增生并向肌原成纖維細胞分化,重塑氣道,誘發肺臟間質纖維化,最終導致患者肺功能的損害,可見阻止成纖維細胞增生以及氣道重建是干預肺慢性炎癥肺功能危害的關鍵[2]。羅格列酮(rosiglitazone,RGZ)是過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)激動劑,臨床使用中發現RGZ 還具有具有抗炎、調節免疫的功效[3],有研究顯示RGZ 可以抑制肺部炎癥,發揮肺損傷保護作用[4-5]。p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein ki-nase,p38MAPK)通路是生物體內重要的信號轉導通路,在成纖維細胞的增殖分化中也發揮著重要作用[6]。本研究觀察了RGZ 對肺成纖維細胞增殖的影響,并探討p38MAPK 通路在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

人胚肺成纖維細胞株(human embryonic lung fibroblast,HELF)購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

RGZ 購自太極集團重慶涪陵制藥廠;青霉素、鏈霉素、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、碘化丙啶(PI)購于美國Sigma 公司;胎牛血清購自杭州四季青生物技術材料研究所;胰蛋白酶、高糖DMEM 干粉培養基購自美國Gibco 公司;細胞計數試劑盒(CCK-8)購自北京全式金生物技術公司;蛋白裂解液、Bradford 蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物技術公司;I 型膠原蛋白(Col I)、III 型膠原蛋白(Col III)、P-p38MAPK、p38MAPK 抗體購自美國Santa Cruz 公司;MK3 多功能酶標儀、細胞培養箱為美國Thermo Fisher 公司產品;流式細胞儀為美國Beckman Coulter 公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養和實驗分組

HELF 細胞于37℃、5% CO2環境下,培養于10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養液中,細胞融合達80%～90%時胰酶消化傳代。實驗分為:對照組、TGF-β1 組、低劑量RGZ(2 mmol/L,LD-RGZ)組和高劑量RGZ(4 mmol/L,HD-RGZ)組[5]。對照組正常培養,TGF-β1 組培養液中加入TGF-β1 至終濃度為10 μmol/L,LDRGZ 和HD-RGZ 組培養液中加入10 μmol/L TGFβ1 后,再分別加入2 mmol/L 或4 mmol/L RGZ。

1.3.2 CCK-8 細胞增殖檢測

對照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ 組細胞,4000 個細胞/孔接種于96 孔板,每組設6 個復孔,置于細胞培養箱24 h、24 h、72 h 后,按照試劑盒說明書每孔加入10 μL CCK-8 液,繼續培養4 h后,測定波長450 nm 處吸光度值即OD450值。

1.3.3 細胞周期檢測

對照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ 組細胞,1×105個細胞/孔接種于6 孔板,每組設6 個復孔,24 h 后胰酶消化收集細胞,迅速注入4℃70%冷乙醇中固定24 h,1000 r/min 離心5 min,PBS 緩沖液洗滌細胞3 次,加入10 μmol/L PI 置冰上待測,流式細胞儀完成檢測,儀器自帶Cell Quest 軟件進行細胞周期分析。

1.3.4 Western blot 檢測蛋白表達

對照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ 組細胞,1×105個細胞/孔接種于6 孔板,每組設6 個復孔,24 h 后胰酶消化收集細胞,1000 r/min 離心5 min,PBS 緩沖液洗滌細胞3 次,每個樣品加入100 μL 蛋白裂解液,使用Bradford 蛋白定量試劑盒定量后,每個樣品取10 μg 蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳,轉印蛋白至PVDF 膜,5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h 后,加入一抗,4℃孵育過夜,換二抗孵育2 h,壓片,顯影,定影,用Image-J 軟件對照內參GAPDH蛋白,計算目的蛋白Col I、Col III、P-p38MAPK 和p38MAPK 的相對灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件分析,多組均數間比較使用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RGZ 對HELF 細胞增殖的影響

對照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ組細胞在24 h、48 h 和72 h 時OD450值存在顯著差異(P<0.05)。其中,24 h、48 h 和72 h 時HDRGZ 組OD450值顯著低于LD-RGZ 組(P<0.05),LD-RGZ 組又顯著低于TGF-β1 組(P<0.05)。見表1、圖1。

2.2 RGZ 對HELF 細胞周期的影響

對照組、TGF-β1 組、LD-RGZ 組和HD-RGZ 組G1 期細胞分別占細胞周期的(91.23±6.32)%、(70.35± 4.14)%、(76.12 ± 4.38)% 和(82.35 ±5.16)%,各組間存在顯著差異(P<0.05)。其中,HD-RGZ 組G1 期細胞比例顯著高于LD-RGZ 組(P<0.05),LD-RGZ 組又顯著高于TGF-β1 組(P<0.05)。見圖2。

2.3 RGZ 對HELF 細胞Col I 和Col III 蛋白的影響

從表2 和圖3 可見,對照組、TGF-β1 組、LDRGZ 組和HD-RGZ 組細胞Col I 和Col III 蛋白表達存在顯著差異(P<0.01)。其中HD-RGZ 組Col I 和Col III 蛋白顯著低于LD-RGZ 組(P<0.01),LDRGZ 組又顯著低于TGF-β1 組(P<0.01)。

2.4 RGZ 對HELF 細胞p38MAPK 通路的影響

從表2 和圖3 可見,對照組、TGF-β1 組、LDRGZ 組和HD-RGZ 組細胞p38MAPK 蛋白表達無顯著性差異(P>0.05),而P-p38MAPK 蛋白表達存在顯著性差異(P<0.01)。其中HD-RGZ 組Pp38MAPK 蛋白顯著低于LD-RGZ 組(P<0.01),LDRGZ 組又顯著低于TGF-β1 組(P<0.01)。

3 討論

氣道的慢性炎癥導致間質成纖維細胞增殖,產生大量細胞外基質,重建氣道是肺纖維的病理生理基礎[7]。PPARγ 激動劑羅格列酮抑制炎性細胞浸潤、分泌致炎因子,拮抗氣道炎癥已被大多數實驗證實[8-9]。研究發現羅格列酮可以通過調控內皮素、一氧化氮等一些生物活性物質抑制心肌成纖維細胞增殖[10]。TGF-β1 是刺激成纖維細胞增殖的常用細胞因子,并且研究已證實了TGF-β1 的致纖維化功能[11],本研究顯示HD-RGZ 組細胞增殖的OD450值顯著低于LD-RGZ 組(P<0.05),LD-RGZ 組又顯著低于TGF-β1 組,說明了RGZ 可以抑制TGFβ1 誘導的HELF 細胞增殖,而且隨著RGZ 劑量的增加抑制活性也升高。細胞周期分析顯示RGZ 主要將HELF 細胞阻滯于G0/G1 期,減少進入DNA合成期的細胞比例,上述結果說明了RGZ 可以計量依賴性的抑制TGF-β1 刺激的肺成纖維細胞增殖。

表1 四組細胞OD450值的比較(n=6)Table 1 Comparison of OD450values of four groups

圖1 細胞增殖的CCK-8 分析Figure 1 CCK-8 analysis of cell proliferation

圖2 四組細胞周期的流式細胞儀檢測Figure 2 Flow cytometry detection of cell cycle in four groups

表2 四組細胞Col I、Col III、P-p38MAPK 和p38MAPK 蛋白的相對灰度值比較(n=6)Table 2 Comparison of relative gray values of Col I,col III,P-P38MAPK and p38MAPK proteins in four groups

圖3 蛋白表達的Western blot 檢測Figure 3 Western blot analysis of protein expression

p38MAPK 是機體內一條重要的細胞增殖通路,通過p38MAPK 蛋白磷酸化激活其絲裂原活化蛋白激酶,從而進一步激活其下游的靶基因,調控成纖維細胞增生和膠原的分泌,靶向p38MAPK 通路的研究顯示可以拮抗間質纖維化[12],王芳等[13]的研究顯示PPARγ 配體4i 可同過抑制MAPK 信號通路抑制小鼠巨噬細胞炎性細胞因子的產生,說明了PPARγ 可以調節MAPK 信號通路,金玲等[14]在乳腺癌的研究中發現羅格列酮可抑制p38 MAPK 信號通路中的磷酸激酶活性,阻止通路的級聯激活,進一步拮抗乳腺癌細胞的遷移和侵襲,Nuwormegbe等[15]發現羅格列酮通過調節p38 MAPK 通路抑制人翼狀胬肉成纖維細胞的纖維化反應。本研究結果顯示HD-RGZ 組P-p38MAPK、Col I 和Col III 蛋白顯著低于LD-RGZ 組(P<0.01),LD-RGZ 組又顯著低于TGF-β1 組,說明了RGZ 可以劑量依賴性的抑制p38MAPK 蛋白磷酸化,阻礙了p38MAPK 通路的激活,進一步減低了成纖維細胞膠原蛋白的合成。p38 MAPK 信號通路調控激活可以刺激成纖維細胞增生,羅格列酮抑制成纖維細胞增殖可能與p38 MAPK 信號通路抑制相關,但羅格列酮抑制p38 MAPK 信號通路的詳細機制還有待進一步的實驗研究來闡明。

綜上所述,本研究顯示羅格列酮可以抑制p38MAPK 通路,從而抑制肺成纖維細胞增殖以及膠原的合成,羅格列酮是否可以用于抗肺間質纖維化的治療還有待進一步的臨床研究來探明。