不同種源華重樓主要生物活性成分地理變異及其相關(guān)性分析

曾平生，厲月橋，周新華，姚甲寶，潘文婷，熊光康

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600)

華重樓（Paris polyphylla var.chinensis(Franch.)）又名七葉一枝花，為百合科重樓屬植物，主要分布在我國長江以南江蘇、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州和云南等省份[1]。華重樓為2015 年版《中國藥典》收載的重樓藥材的基原植物，以干燥根莖入藥，主要可用于消腫止痛、清熱解毒、定驚涼肝等藥用功能，可治療毒蛇咬傷、跌打傷痛、咽喉腫痛、驚風(fēng)抽搐等病癥[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥理研究表明，華重樓化學(xué)成分包括甾體皂苷、蛻皮激素及其糖苷、黃酮等，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ等是其重要的生物活性成分和衡量藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)[3]，具有抗腫瘤[4-6]、止血鎮(zhèn)痛、抗炎抑菌、調(diào)節(jié)免疫力[7]、促進(jìn)骨細(xì)胞增殖分化等多方面功能[8]，為我國傳統(tǒng)常用中藥云南白藥、宮血寧膠囊等 80 余種中成藥的重要原料[9]。近年來，隨著對華重樓野生種質(zhì)資源的無序開采，許多地區(qū)種質(zhì)資源已瀕臨滅絕、種質(zhì)遺傳多樣性銳減。開展華重樓天然種質(zhì)收集、保存和評價(jià)工作，篩選生物活性成分高的優(yōu)良種質(zhì)，對華重樓種質(zhì)資源保護(hù)和合理利用具有十分重要的意義[10]。

目前，國內(nèi)外對于華重樓的研究集中在化學(xué)成分分析與藥理活性研究[11-13]、有效成分提取[14]、治療機(jī)制[15-16]和人工育苗、栽培方面[17-18]。而許多藥用植物的生物活性成分與原產(chǎn)地氣候生態(tài)因子密切相關(guān)，并在長期進(jìn)化過程中形成特有的地理種源變異模式。因此研究重樓種質(zhì)變異規(guī)律，優(yōu)良種質(zhì)篩選和人工栽培均具有重要意義。陳鐵柱等通過研究，證實(shí)了我國華重樓西部產(chǎn)區(qū)四川、重慶、云南等省7 種重樓皂苷甾體含量具有明顯差異，與氣候生態(tài)因子間亦存在密切關(guān)系[19]。但現(xiàn)有研究還未能從全分布區(qū)尺度反映華重樓主要生物活性成分的種源差異，并系統(tǒng)揭示華重樓根莖總皂苷、總酚酸、黃酮性狀指標(biāo)的地理種源變異模式及其與原產(chǎn)地地理、氣候因子的相關(guān)關(guān)系，同時(shí)關(guān)于華重樓主要生物活性成分間的相關(guān)性分析方面的研究也相對較少。而對藥用植物開展種源評價(jià)、優(yōu)良種質(zhì)鑒定是種植基地選址和遺傳改良十分基礎(chǔ)的工作。

本研究在對我國華重樓天然分布區(qū)10 個(gè)種源種質(zhì)收集的基礎(chǔ)上，開展了不同種源根莖器官總酚酸、黃酮、重樓總皂苷和皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的地理變異規(guī)律研究及主要生物活性成分間的相關(guān)性分析，旨在為華重樓遺傳改良和豐產(chǎn)栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的收集與處理

華重樓種源種質(zhì)收集點(diǎn)選擇與地理氣候因子信息的收集。首先查閱我國華重樓天然分布范圍和分布地點(diǎn)相關(guān)資料基礎(chǔ)上，設(shè)置了河南、湖北、安徽、江西、廣東、廣西、重慶和湖南8 省份10 個(gè)地理種源收集地點(diǎn)，所采種源樣本基本覆蓋了華重樓在中國主要地理分布區(qū)。各種源所在的地理、生態(tài)氣候因子見表1。計(jì)算種源地與溫度相關(guān)的氣象因子時(shí)，以當(dāng)?shù)貧庀笈_(tái)站數(shù)據(jù)為依據(jù)，按海拔每上升100 m，溫度降低0.55℃進(jìn)行修正[20]。

表1 華重樓種源采樣地理位置及主要?dú)庀笠蜃覶able 1 Geographical locations and meteorological factors of the sampled provenances of Paris polyphyllavar. chinensis

華重樓種源種質(zhì)的收集。于2018 年9 月—12 月，在每一種源選擇4—5 a 生，生長健康、發(fā)育完好的華重樓植株30 株以上，植株間距離40 m以上，采集根莖部作為種源樣品。樣品采回后，經(jīng)中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心植物分類專家王燕良高級工程師鑒定，均為華重樓植株。

1.2 樣品檢測與分析

1.2.1 總黃酮、總酚酸含量測定 先將華重樓根莖樣品分單株用清水洗凈，放入110℃烘箱殺青30 min，然后在45℃條件下烘干至恒質(zhì)量。將烘干的樣品粉碎過100 目篩，作為待測樣品。

總黃酮的測定采用三氯化鋁法進(jìn)行測定[21]。稱取粉碎樣品0.2 g，3 mL 95%乙醇，50℃水浴超聲處理30 min，收集至10 mL 容量瓶，重提3 次，合并上清液，冷卻至刻度，備用。取7 mL 上清液于25 mL 的比色管中，加入1.5% AlCl38 mL 和醋酸-醋酸鈉的緩沖液（PH 5.5）4 mL，并用50% 乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5 h，于415 nm下測試吸光度值。配置一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述樣品溶液的顯色方法同步顯色，于415 nm下測試吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，顯色液中蘆丁的質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

總酚酸含量采用高效液相色譜法測定[22]。對照品溶液的制備，取迷迭香酸對照品和丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL 含迷迭香酸7 μg、丹酚酸B60 μg 的混合溶液，即得。供試品溶液的制備 取供試品5 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加水使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定時(shí)，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，測定。色譜條件為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長為25 cm，內(nèi)徑為4.6 μm，粒徑為5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B；檢測波長為286 nm；柱溫為30℃；流速為每分鐘1.0 mL。

1.2.2 重樓皂苷含量測定 重樓皂苷含量采用高效液相色譜法測定[23]。對照品溶液的制備，取重樓皂苷I 對照品、重樓皂苷II 對照品、重樓皂苷VI 對照品及重樓皂苷VII 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 各含0.4 mg 的混合溶液，即得。供試品溶液的制備，取樣品粉末（過三號篩），稱取0.5 g 左右樣品，精密加入乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，待冷卻后再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，進(jìn)樣。色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫，檢測波長為203 nm，進(jìn)樣量10 μL。以下為華重樓樣品皂苷的HPLC 色譜圖（圖1）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用WPS EXCEL 軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理、統(tǒng)計(jì)；利用SPSS 20. 0 軟件進(jìn)行方差分析、多重比較、相關(guān)和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 華重樓根莖主要生物活性成分含量的種源差異

不同種源華重樓根莖主要生物活性成分含量比較（表2）。由表2 可以看出，不同種源華重樓根莖生物活性成分含量具有很大差異，總酚酸含量的變異范圍為1.718～5.436 mg·g?1，廣西桂林種源總酚酸含量最高，達(dá)5.436 mg·g?1，是總酚酸含量最低江西新余種源的3.16 倍。總黃酮含量的變異范圍為0.780～1.457 mg·g?1，含量最高的廣西桂林種源與含量最低的安徽祁門種源間相差了1.87 倍。不同種源總重樓皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ）含量變異幅度為0.107～7.399 mg·g?1，其中江西豐城種源含量最高，河南新縣種源含量最低，前者是后者的69.149 倍。

圖1 華重樓4 種皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜Fig.1 The HPLC chromatography of phloridzin and trilobatin in Paris polyphylla var.chinensis. sample

在華重樓根莖重樓皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ含量中，皂苷Ⅰ的變異范圍為0.008～2.106 mg·g?1，皂苷Ⅱ的變異范圍為0.000～0.646 mg·g?1，皂苷Ⅵ的變異范圍為0.000～0.521 mg·g?1，皂苷Ⅶ的變異范圍為0.00～9.170 mg·g?1。其中河南新縣種源未能檢出皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ號含量，廣西桂林種源未能檢出皂苷Ⅱ、Ⅵ含量。方差分析表明，不同種源華重樓根莖總酚酸、總黃酮、總皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ）、皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和皂苷Ⅶ的含量均存在極顯著差異（P< 0.01）。

2.2 華重樓根莖主要活性成分含量與氣候生態(tài)因子相關(guān)性分析

對華重樓根莖主要活性成分含量與氣候生態(tài)因子間的相關(guān)性的顯著性檢驗(yàn)表明，華重樓根莖總酚酸含量與海拔、總黃酮含量與全年日照時(shí)數(shù)、皂苷Ⅱ含量與1 月均溫間相關(guān)性顯著（P< 0.05），相關(guān)系數(shù)值分別為0.662、?0.708 和0.752。說明總酚酸含量與海拔、皂苷Ⅱ含量與1 月均溫間存在中度正相關(guān)關(guān)系，總黃酮含量與全年日照時(shí)數(shù)間存在中度負(fù)相關(guān)關(guān)系。總皂苷含量與海拔、皂苷Ⅱ與年均溫、皂苷Ⅵ含量與7 月均溫、皂苷Ⅶ含量與海拔的相關(guān)性極顯著（P< 0.01），其相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到?0.840、0.877、0.821 和?0.766，表明總皂苷與海拔間呈高度負(fù)相關(guān)，皂苷Ⅱ與年均溫、皂苷Ⅵ與7 月均溫間存在高度正相關(guān)關(guān)系，皂苷Ⅶ含量與海拔存在中度正相關(guān)關(guān)系。總酚酸含量與東經(jīng)和全年日照時(shí)數(shù)、總黃酮與東經(jīng)、皂苷Ⅰ與東經(jīng)相關(guān)系數(shù)較小且達(dá)未到顯著水平（P> 0.05）但存在較弱的負(fù)相關(guān)性，而總皂苷含量與年均溫和7 月均溫，皂苷Ⅶ含量與年均降雨量間存在一定的正相關(guān)性（表3）。

表2 不同種源華重樓主要生物活性成分含量差異Table 2 The difference of main medicinal active constituents contents of Paris polyphyllavar.chinensis from different provenances

2.3 華重樓根莖主要藥物活性成分含量相關(guān)分析

由表4 可以看出，華重樓根莖中總酚酸與總黃酮含量、皂苷Ⅰ與皂苷Ⅱ含量間相關(guān)性顯著，其相關(guān)系數(shù)分別為0.753、0.777 和0.637。說明華重樓根莖中總酚酸與總黃酮含量、總黃酮與皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ與皂苷Ⅱ含量呈中度正相關(guān)。總黃酮與皂苷Ⅰ含量和總皂苷與皂苷Ⅶ間的相關(guān)性達(dá)極顯著水平，總皂苷與皂苷Ⅶ的相關(guān)系數(shù)為0.941，說明總皂苷與皂苷Ⅶ含量呈高度正相關(guān)。其它指標(biāo)間的相關(guān)性均未達(dá)到顯著性水平，但總酚酸含量與總皂苷、總酚酸與皂苷Ⅶ含量、總黃酮與皂苷Ⅶ含量相關(guān)系數(shù)均存在負(fù)相關(guān)性，皂苷Ⅰ與皂苷Ⅵ呈正相關(guān)性。

2.4 不同種源華重樓藥用成分含量聚類分析

以華重樓根莖總酚酸、黃酮和皂苷含量為特征指標(biāo)，對10 個(gè)華重樓種源聚類分析結(jié)果（圖2）。從圖2 可以看出，以歐式距離15 為分界閾值，可將華重樓種源聚類為3 個(gè)類群，分別為低酚酸、低黃酮、高皂苷含量類群，高酚酸、高黃酮、低皂苷類群和中酚酸、中黃酮、中皂苷類群。其中安徽祁門種源屬低總酚酸、低黃酮和高皂苷含量類群，河南新縣、湖北宜昌和重慶石柱屬高酚酸、高黃酮、低皂苷類群，其余種源屬中酚酸、中黃酮、中皂苷類群。

表3 華重樓主要生物活性成分與產(chǎn)地氣候生態(tài)因子相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of main medicinal active constituen and ecological factors of Paris polyphyllavar. chinensis

表4 華重樓根莖中主要生物活性成分的相關(guān)性分析Table 4 Analysis of correlation between main medicinal active constituent of Paris polyphyllavar.chinensis

圖2 不同種源華重樓總皂苷、黃酮和總皂苷含量聚類分析Fig.2 Cluster Analysis of phloridzin and trilobatin and total saponin contents in Paris polyphylla var.chinensis of different provenances

3 討論

重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等4 種活性成分含量是中藥材重樓質(zhì)量的主要評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究表明不同種源間華重樓根莖中總酚酸、總黃酮和重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ 4 個(gè)重樓皂苷及其總含量差異極顯著。從種源所處的地理位置來看，華重樓分布區(qū)北部種源重樓皂苷含量總體低于中南部種源含量。因此，今后在華重樓的中南部種源開展優(yōu)良種質(zhì)選擇或開展人工仿生栽培，將取得較好的效果。

本研究通過對華重樓根莖中總酚酸、總黃酮和重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ 4 個(gè)重樓皂苷及其總含量與其原產(chǎn)地氣候地理因子的相關(guān)分析表明，原產(chǎn)地海拔分布高的華重樓種源，具有較高的總酚酸含量，但其總皂苷含量和皂苷Ⅶ較低，年均溫和1 月均溫較高的種源根莖中皂苷Ⅱ含量相應(yīng)較高，7 月均溫高的種源皂苷Ⅵ含量相應(yīng)較高，而全年日照數(shù)高的種源總黃酮含量較低。因此，在海拔低、年均溫、1 月均溫和7 月均溫高的地區(qū)開展華重樓優(yōu)良種質(zhì)篩選工作，更易于獲得重樓總皂苷、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ和皂苷Ⅶ含量高的優(yōu)良種質(zhì)，而在海拔高和全年日照時(shí)數(shù)少的地區(qū)更容易篩選到高總酚酸和總黃酮含量的優(yōu)良種質(zhì)。

華重樓根莖中總酚酸與總黃酮含量、總黃酮與皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ與皂苷Ⅱ含量呈中度正相關(guān)關(guān)系，總皂苷與皂苷Ⅶ含量呈高度正相關(guān)關(guān)系。這說明通過對這些具有相關(guān)性次生代謝物二者中一個(gè)指標(biāo)的檢測，可以初步評估另外一個(gè)指標(biāo)含量的高低。這種方法在野外樣品選優(yōu)評價(jià)的初選階段，可以有效降低樣品檢測的工作量，提高評價(jià)效率。本研究中總酚酸與總黃酮，總黃酮與皂苷Ⅰ類別之間的顯著正相關(guān)性，可能與這些次生代謝物對原產(chǎn)地復(fù)雜生態(tài)環(huán)境因子響應(yīng)具有高度相似性有關(guān)，此方面還有待于進(jìn)行更深入的研究。

本研究證實(shí)了不同種源華重樓根莖主要生物活性成分含量存在極顯著差異，然而對華重樓生物活性成分形成地理種源差異的機(jī)制尚不明確，有待于在其全分布區(qū)進(jìn)行多點(diǎn)種源試驗(yàn)，解析其主要生物活性成分的形成機(jī)制。

4 結(jié)論

不同種源間華重樓根莖中總酚酸、總黃酮和重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ4 個(gè)重樓皂苷及其總含量差異極顯著。廣西桂林為總酚酸和總黃酮含量最高的種源，安徽祁門為總重樓皂苷含量最高的種源。華重樓根莖中總酚酸含量與原產(chǎn)地海拔、皂苷Ⅱ與1 月均溫呈中度正相關(guān)關(guān)系，總黃酮含量與全年日照時(shí)數(shù)、皂苷Ⅶ與海拔呈中度負(fù)相關(guān)關(guān)系。總皂苷與海拔間呈高度負(fù)相關(guān)關(guān)系，皂苷Ⅱ與年均溫、皂苷Ⅵ與7 月均溫間均呈高度正相關(guān)關(guān)系；華重樓根莖中總酚酸與總黃酮含量、總黃酮與皂苷Ⅰ含量、皂苷Ⅰ與皂苷Ⅱ含量呈中度正相關(guān)關(guān)系，總皂苷與皂苷Ⅶ含量呈高度正相關(guān)關(guān)系。通過聚類分可將華重樓種源劃分為三個(gè)類群，安徽祁門屬低酚酸、低黃酮、高皂苷類群；河南新縣、湖北宜昌和重慶石柱屬高酚酸、高黃酮、低皂苷類群；湖南張家界、江西豐城、江西分宜、廣西桂林、江西信豐和廣東連州屬中酚酸、中黃酮和中皂苷類群。