柳葉亞菊揮發油對煙草甲與赤擬谷盜的毒殺作用

楊盈盈，邵亞洲，石毛寧，徐 婕，梁俊玉

西北師范大學生命科學學院，蘭州市安寧區安寧東路967 號 730070

煙草甲（Lasioderma serricorne）屬鞘翅目竊蠹科昆蟲，是最常見的倉儲害蟲之一。煙草甲的食性復雜，在農作物倉庫對谷物和豆類具有嚴重的為害性；在煙草倉庫中對儲藏的雪茄、卷煙和煙葉等也有很大的為害［1］。在20 世紀90 年代，我國曾對為害全國貯煙害蟲的為害程度進行了調查，發現全國每年因貯煙害蟲造成的煙葉質量損失率為1.64%［2-3］。赤擬谷盜（Tribolium castaneum）屬鞘翅目擬步甲科，對水稻、小麥、玉米等各類糧、油、肉類及其加工制品等都可造成嚴重為害［4］。其為害周期長，繁殖速度快，且成蟲身體上的臭腺會分泌物質容易導致物質結塊并使其顏色發生變化，發出腥霉味臭氣，且其分泌物中含有致癌物苯醌［5-6］。目前,防治煙草甲和赤擬谷盜的方法主要是使用化學合成殺蟲劑—磷化氫熏蒸［7］。雖然化學殺蟲劑具有很好的毒殺效果，但長期使用會危及人類健康并對環境造成污染，且會增加煙草甲和赤擬谷盜的抗藥性［8-9］。因此，尋找可代替化學殺蟲劑的新型農藥十分重要。

近年來新型植物源殺蟲劑的研發受到了人們的高度重視。其中，植物揮發油具有抑菌消炎、抗氧化、驅蚊殺蟲等功效，有開發成天然抑菌劑、抗氧化劑以及殺蟲劑等的潛力［10］；且具有對環境無害、毒性較低、對非靶標生物無害、對人畜安全、易于分解且對害蟲不易產生抗性等特點［11］。目前關于植物揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺和熏蒸活性已有較多研究，鞠克升［12］報道了珠光香青（Anaphalis margaritacea）揮發油對赤擬谷盜的觸殺活性（LD50為41.25 μg/頭）。吳彥等［13］研究提出了側柏（Platycladus orientalis）揮發油對赤擬谷盜和煙草甲具有觸殺活性（LD50分別為48.58 μ g/頭和50.45 μg/頭）和熏蒸活性（LC50分別為145.40 mg/L和39.25 mg/L）。張莉娟等［14］試驗發現頭花杜鵑（Rhododendron capitatum）揮發油對赤擬谷盜（LD50為104.92 μg/頭）和煙草甲（LD50為44.40 μg/頭）有觸殺活性。Yang 等［15］研 究 表 明 山 蒼 子 果 實（Litsea cubeba）揮發油對煙草甲有熏蒸活性（LC50為22.97mg/L）。程昉等［16］報道了牛尾蒿（Artemisia dubia）、灰苞蒿（A.rocburghiana）、紅足蒿（A.rubripes）、白蓮蒿（A.sacrorum）和華北米蒿（A.giraldii）等5 種蒿屬植物揮發油對煙草甲和嗜卷書虱有驅避活性，其中紅足蒿揮發油對煙草甲的驅避活性最好，牛尾蒿揮發油對嗜卷書虱的驅避活性最顯著。

許多亞菊屬植物都具有消炎止血、清熱解毒、驅蚊殺蟲、消炎止癢等藥理作用，并且許多亞菊屬植物中含有揮發油［17］。有研究表明，細葉亞菊（Ajania tenuifolia）、川甘亞菊（Ajania potaninii）、光苞 亞 菊（Ajania nitida）和 絲 裂 亞 菊（Ajania nematoloba）等的揮發油對煙草甲（Lasioderma serricorne）和赤擬谷盜有觸殺、熏蒸和驅避活性［3,18-19］，其中光苞亞菊揮發油對煙草甲的觸殺活性最強。Liang 等［20］試驗認為灌木亞菊（Ajania fruticulosa）揮發油對赤擬谷盜和嗜卷書虱（Liposcelis bostrychophila）均有觸殺和驅避活性。王思敏等［21］提出了鋪散亞菊（Ajania khartensis）揮發油對馬鈴薯莖線蟲（Ditylenchus destructor）具有較強的觸殺作用。柳葉亞菊（Ajania salicifolid）可用于清熱解毒、清肺止咳和防蟲驅蚊［22-23］。目前有關柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜殺蟲活性的影響尚鮮見報道。為此，設置了柳葉亞菊揮發油的化學成分分析及其對兩種常見倉儲害蟲的毒殺作用試驗，以期為倉儲害蟲的綠色防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料采集和揮發油提取

柳葉亞菊（Ajania salicifolia）于2018 年8 月采自甘肅省蘭州市榆中縣（經緯度35°78′34″N，103°93′79″E，海拔3 200 m）。將柳葉亞菊植物的地上部分陰干、粉碎、稱取1 000 g 后轉移到揮發油提取器中。經過6 h 蒸餾提取后收集揮發油，殘留水分用無水硫酸鈉去除，得到揮發油。將提取得到的柳葉亞菊揮發油裝入玻璃小瓶中，密封后放到4 ℃冰箱中保存。

1.2 供試昆蟲

將煙草甲和赤擬谷盜飼養在容積為0.5 L 的玻璃瓶中，飼以10∶1 質量比混合的小麥粉與酵母粉。培養溫度為（29±1）℃，相對濕度為70%～80%。試驗昆蟲（試蟲）為羽化后1～2 周的成蟲，不分雌雄。

1.3 儀器與試劑

6890N 氣相色譜分析儀（美國Agilent 公司），配有5973N 質譜分析儀，氫火焰離子化檢測器（GC-FID），NIST2.0 質譜數據庫；移液槍（量程范圍：0.1～2.5、0.5～10 和10～100 μL，大龍興創實驗儀器有限公司）；正己烷（分析純，煙臺市雙雙化工有限公司）；除蟲菊酯（純度27%，陜西米爾康生物科技有限公司）；避蚊胺（DEET，純度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；玻璃樣品瓶、玻璃培養皿購于北京玻璃儀器廠。

1.4 柳葉亞菊揮發油GC/MS 分析

樣品前處理：將提取得到的柳葉亞菊揮發油經正己烷萃取，無水硫酸鈉處理后過濾，常壓濃縮至不含溶劑，對得到的無色揮發油進行GC/MS分析。

GC/MS 條件：色譜柱為熔融石英毛細管柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜升溫程序為：初始溫度，保持15 min。用正己烷將柳葉亞菊揮發油溶解，稀釋至1%（體積分數）注射到氣相色譜儀中。氣相色譜參數：汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣；進樣量1 μL；流速1.0 mL/min；分流比1∶10。質譜參數：電離方式為EI電離；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍20～550 m/z。最后采用與正構烷烴（C8～C24）的保留時間和質譜數據庫（NIST 2.0 和Wiley 275 libraries）數據比較鑒定揮發油組分。采用峰面積歸一化法，根據各化學成分的分子量，計算出各化學成分在揮發油中的相對含量。

1.5 生物活性的測定

1.5.1 觸殺活性

參考文獻［24］的方法測定柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性。將試蟲放在培養皿中并置于冰袋上，用移液槍取0.5 μL 樣品的正己烷稀釋液分別滴于停止行動的2 種試蟲前胸背板上，用藥后放入直徑2.5 cm，高5.5 cm 的玻璃瓶中。正己烷為空白對照，除蟲菊酯（濃度分別為0.200 0%、0.100 0%、0.050 0%、0.025 0%和0.012 5%，體積分數）為陽性對照，樣品設置5 個濃度梯度（15.00%、10.00%、6.67%、4.50%和2.98%，體積分數），每個濃度重復5 次，每次重復試蟲10 頭。處理后置于溫度（29±1）℃，相對濕度為70%～80%的恒溫培養箱中暗培養24 h，觀察記錄試蟲死亡情況，并計算死亡率與校正死亡率，采用SPSS 22.0統計軟件分析計算半致死劑量LD50（μg /頭）。

1.5.2 熏蒸活性

參考文獻［25］的方法測定柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜熏蒸活性。將試蟲放入玻璃瓶中，用正己烷將柳葉亞菊揮發油配制成5 個濃度梯度（50.000%、25.000%、12.500%、6.250%和3.125%，體積分數）的稀釋溶液。用移液槍取10μL 的稀釋溶液，滴在覆蓋于瓶蓋內頂部直徑為2 cm 的濾紙片上,待溶劑揮發20 s 后，迅速將瓶蓋擰緊并密閉。正己烷為空白對照，甲基溴［20］和磷化氫［15］分別作為赤擬谷盜和煙草甲熏蒸活性的陽性對照。每個濃度重復5 次，每次重復試蟲10頭。處理后置于溫度（29±1）℃，相對濕度70%～80%的恒溫培養箱中暗培養24 h，觀察記錄死亡情況，并采用SPSS 22.0 統計軟件分析計算半數致死濃度LC50（mg/L）。

1.5.3 驅避活性

參考文獻［26］的方法測定柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的驅避活性。用正己烷溶解柳葉亞菊揮發油并制成5 個連續濃度（0.500 0%、0.100 0%、0.020 0%、0.004 0%和0.000 8%，體積分數）梯度的溶液。取與培養皿（直徑9 cm，高1.9cm）底相同直徑的濾紙，沿著中線對半剪開，一半滴加500 μL 稀釋溶液，另一半滴加等量正己烷作為空白對照。待溶劑自然揮發后，立即用固體膠將處理過的濾紙相向緊貼在培養皿底部，注意粘牢不留縫隙，以防止試蟲鉆入濾紙下面，影響觀察效果。將20 頭試蟲從培養皿中央投入，迅速蓋上培養皿蓋子并密封。不同濃度的樣品用相同的方法處理5 次。避蚊胺作為陽性對照。在處理2 h和4 h 后分別統計出現在不同區域內的試蟲數量。并計算驅避率（Percentage repellency，PR）。

式中：Nc表示出現在陰性對照區域內的試蟲數量，頭；Nt表示出現在實驗組區域內的試蟲數量，頭。計算出PR 的平均值±標準誤。

1.5.4 數據處理

利用Abbott’s formula 軟件計算校正死亡率。采用IBM SPSS V22.0 統計軟件計算觸殺活性的半致死劑量（LD50）和熏蒸活性的半數致死濃度（LC50）。采用方差分析法，用IBM SPSS V22.0 軟件進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 柳葉亞菊揮發油的化學成分分析

柳葉亞菊揮發油的GC/MS 分析結果見表1。從柳葉亞菊揮發油中鑒定出了23 種化合物，占揮發油總量的96.13% 。 其主要成分為樟腦（36.50%）、杜松腦(16.44%)、桉葉油醇（9.61%）和α-紅沒藥醇（4.77%）。化合物類型以烯、醇和酮等為主。

2.2 觸殺活性

柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性見表2。柳葉亞菊揮發油對赤擬谷盜和煙草甲具有一定的觸殺作用，LD50分別為64.51 μg/頭和25.66 μg/頭。柳葉亞菊揮發油對煙草甲的觸殺活性高于赤擬谷盜2.5 倍，因此柳葉亞菊揮發油對煙草甲表現出較強的觸殺活性，但柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性弱于藥劑對照。柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜觸殺作用存在差異，這可能與揮發油組成成分以及兩種昆蟲體內的某些酶有關。與鞠克升等［12］、吳彥等［13］和張莉娟等［14］對珠光香青揮發油、側柏揮發油和頭花杜鵑揮發油對煙草甲與赤擬谷盜的觸殺活性研究結果相比，柳葉亞菊揮發油對煙草甲的觸殺活性強于側柏揮發油和頭花杜鵑揮發油。另外，本研究中只測試了柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜成蟲的殺滅活性，而對其幼蟲和卵的殺滅活性還需進一步試驗。

表1 柳葉亞菊揮發油的化學成分及相對含量Tab.1 Chemical compositions and their relative contents in A. salicifolid essential oil

表2 柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性①②Tab.2 Contact toxicity of A. salicifolid essential oil against L. serricorne and T. castaneum

2.3 熏蒸活性

柳葉亞菊揮發油對赤擬谷盜和煙草甲的熏蒸活性見表3。柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜具有較強的熏蒸活性，LC50分別為26.60 mg/L 和24.29 mg/L。雖然柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性弱于藥劑對照，但與吳彥等［13］和Yang 等［15］對側柏揮發油和山蒼子揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性研究結果相比，柳葉亞菊揮發油對赤擬谷盜的熏蒸活性優于側柏揮發油，對煙草甲的熏蒸活性也優于側柏揮發油，而與山蒼子果實揮發油的熏蒸活性相近。

表3 柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性①Tab.3 Fumigant activity of A. salicifolid essential oil against L. serricorne and T. castaneum

2.4 驅避活性

柳葉亞菊揮發油對兩種害蟲的驅避活性見表4。結果表明，柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜具有一定的驅避活性，但對赤擬谷盜的驅避活性更明顯。使用濃度0.500 0%時，其處理2 h 和4 h 后對赤擬谷盜的驅避率高于90%，且與避蚊胺的驅避活性相近。使用濃度0.100 0%和0.020 0%時，處理4 h 后揮發油對赤擬谷盜驅避活性比處理2 h 后的驅避活性略好，均與避蚊胺的驅避活性相近；處理濃度0.000 8%時，處理2 h 和4 h 后對赤擬谷盜的驅避效果與避蚊胺相當。可見高測試濃度時柳葉亞菊揮發油對煙草甲的驅避率在60%以上，驅避活性較強；低濃度下，對煙草甲的驅避活性較弱。

表4 柳葉亞菊揮發油和避蚊胺對煙草甲和赤擬谷盜的驅避活性①Tab.4 Repellent activity of A. salicifolid essential oil and DEET against L. serricorne and T. castaneum

3 結論

柳葉亞菊揮發油的主要成分為單萜和倍半萜，其中單萜類化合物占絕大多數，主要以樟腦、杜松腦和桉葉油醇為主。柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜觸殺活性LD50分別為25.66 μg/頭和64.51 μg/頭，對煙草甲的觸殺活性明顯強于赤擬谷盜。柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜熏蒸活性LC50分別為26.60 mg/L 和24.29 mg/L，對兩種試蟲均具有顯著的熏蒸作用效果。在高濃度（0.500 0%）條件下分別處理2 h 和4 h 后柳葉亞菊揮發油對煙草甲的驅避率高于60%，對赤擬谷盜的驅避率高于90%。因此，柳葉亞菊揮發油對煙草甲和赤擬谷盜均具有較顯著的防治效果，具有開發為新型植物源煙草倉儲害蟲殺蟲劑的潛質。