苦瓜多糖對環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠免疫功能的影響*

周惠萍，周東海，彭宇軒**

(1．湖北科技學院基礎醫學院，湖北 咸寧 437100；2．華中農業大學動物科學技術學院)

苦瓜(momordica charantia L)是葫蘆科植物，其苦寒、無毒、除邪熱、解疲乏、清心明目、益氣壯陽[1]，具有多種藥理特性，如抗高血糖、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用[2]，主要成分為多糖、蛋白質、類黃酮、三萜等[3]。多糖廣泛存在于植物中，在臨床上常用作治療劑，主要作用是增強和激活巨噬細胞的免疫反應、抗腫瘤活性、促傷口愈合和其他治療作用[4]。本研究探討了苦瓜多糖(momordica charantia polysaccharide，MCP)對環磷酰胺(cyclophosphamide，CY)誘導免疫抑制小鼠免疫功能的影響，及可能的作用機制，為更好地開發苦瓜的藥理作用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 動物

SPF 級KM雄性小鼠，體重(30±2)g，購自華中農業大學實驗動物中心，動物自由攝食和飲水，在室溫(24±1)℃、濕度(65±5)%、晝夜12h交替標準環境條件下，適應性飼養1周后用于實驗。

1.1.2 試劑

苦瓜多糖(含量為90%，西安萬方生物技術有限公司，批號2018092801)；環磷酰胺(江蘇恒瑞藥業有限公司，批號15073125)；印度油墨(北京來寶科技有限公司)；豚鼠血清(江萊生物)；ConA(康朗生物)；無菌Hanks和RPMI 1640培養基(Gibico公司)；CCK-8(Bioss公司)。

1.1.3 儀器

酶標儀(美國賽默飛公司，型號MK3)；全自動血液分析儀(日本希森美康公司，型號F2340)；CO2細胞培養箱(美國賽默飛公司，型號3423)；電子天平(北京賽多利斯公司，型號BSA124S-CW)；超潔凈工作臺(蘇凈安泰公司，型號SW-SJ-2FD)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠分組及處理

參考文獻方法[5-6]造小鼠免疫功能低下模型，將50只小鼠按隨機數字表法分為5組，每組10只，即正常對照組(C)、CY模型對照組(M)、低劑量治療組(T1)、中劑量治療組(T2)和高劑量治療組(T3)。第1d至3d，除正常對照組腹腔注射生理鹽水外，其他各組于小鼠腹腔注射CY 80mg/kg。在第4d至10d，正常對照組和模型對照組灌胃雙蒸水，對低、中和高劑量組小鼠分別灌胃MCP 1次，劑量分別是50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg。在最后一次喂藥24h后進行采樣檢測。

1.2.2 小鼠WBC計數的測定

全自動血液細胞分析儀檢測各組抗凝血白細胞水平。

1.2.3 小鼠免疫器官指數的測定

實驗第10d，稱量小鼠的體重后，使用頸椎脫臼法處死小鼠，分別對小鼠的胸腺和脾臟精準稱重，計算胸腺指數和脾臟指數，公式如下：

胸腺指數=胸腺重量(mg)/體重(g)

脾臟指數=脾臟重量(mg)/體重(g)

1.2.4 小鼠脾淋巴細胞增殖的測定[7]

無菌取小鼠脾臟，放入無菌Hanks液中，用200目篩網過濾成單細胞懸液。通過1 000rpm離心5min進一步純化細胞懸液，棄上清液。將沉淀的細胞與無菌蒸餾水1mL混合約30s，之后加入1mL 1.8%NaCl。接著用無菌PBS洗滌細胞懸液3遍，調整脾細胞懸液最終濃度至1×10-6個/mL。將脾細胞懸液分兩孔加入96孔培養板中，每孔100μL，再加入7.5μL ConA，置37℃，5%CO2培養箱中靜止培養24h。每孔加入10μL CCK-8后，置37℃，5%CO2培養箱孵育4h，在酶標儀450nm的波長下測定吸光度(A)值，計算小鼠脾淋巴細胞增殖比例，公式如下：

淋巴細胞增值比例(%)=A(實驗組)/A(對照組)×100%

1.2.5 小鼠巨噬細胞吞噬作用的測定[8]

在最后一次給藥后，將印度墨水稀釋5倍，然后以10mL/kg的劑量通過尾靜脈注射，通過眼眶兩次采集血液共20μL，時間分別是注射印度墨水后2min(t1)，和注射印度墨水后10min(t2)，隨后立即將血液與4mL 0.1%(w/v)Na2CO3溶液混合。最后在酶標儀680nm的波長下測量吸光度OD1和OD2值，計算小鼠的碳粒廓清指數(κ)和吞噬指數(α)，公式如下：

(BM：體重；LM：肝臟重量；SM：脾臟重量)

1.2.6 小鼠血清溶血素的測定[9]

在給藥第6d腹腔注射20%兔紅細胞懸液0.2mL/只進行免疫。在第10d處死小鼠后制備血清。兔紅細胞用生理鹽水1 000r/min，5min洗滌3次備用。將0.1mL小鼠血清、0.9mL生理鹽水、0.25mL的豚鼠血清和0.25mL 1.5%的兔紅細胞懸液加到離心管中，混勻后置于37℃的水浴箱中1h，隨后以2 500rpm/min離心5min，吸取上清液，最后在酶標儀450nm的波長下測定吸光度值。

1.3 統計學方法

本實驗數據采用SPSS 25.0統計軟件進行獨立樣品t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 MCP對小鼠WBC計數的影響

由表1可見，CY模型組小鼠的WBC計數較正常對照組明顯降低(P<0.01)，說明造模成功；MCP中、高劑量組小鼠WBC計數較CY模型對照組均明顯增加(P<0.05或P<0.01)，說明MCP對免疫抑制小鼠的WBC計數有明顯提升作用。

表1 MCP對免疫抑制小鼠WBC計數，臟器指數以及溶血素的影響

2.2 MCP對小鼠臟器指數的影響

由表1可見，CY模型對照組小鼠的胸腺指數和脾臟指數較正常對照組明顯降低(P<0.01)，說明小鼠免疫功能受到明顯抑制；MCP中、高劑量組小鼠胸腺指數和脾臟指數較CY模型對照組明顯升高(P<0.05或P<0.01),說明隨著MCP治療劑量的增加，免疫抑制小鼠的臟器指數逐漸增加，但MCP高劑量組的臟器指數仍低于空白對照組。

2.3 MCP對小鼠溶血素水平的影響

由表1可見，CY模型組小鼠的溶血素水平較正常對照組明顯降低(P<0.01)；MCP高劑量組小鼠的溶血素水平較CY模型對照組明顯升高(P<0.05)。說明MCP對免疫抑制小鼠的溶血素水平有一定改善作用。

2.4 MCP對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

由圖1可見，CY模型組小鼠的脾淋巴細胞增殖較正常對照組明顯降低(P<0.01)；MCP中、高劑量組小鼠的脾淋巴細胞增殖較CY模型對照組明顯升高(P<0.01)，說明MCP可有效促進免疫抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖。

與CY模型對照組比較，**P<0.01

2.5 MCP對小鼠巨噬細胞吞噬作用的影響

由圖2可見，CY模型對照組小鼠的廓清指數和吞噬指數較正常對照組皆明顯降低(P<0.01)，說明CY明顯降低了小鼠巨噬細胞的吞噬作用；MCP高劑量組小鼠的廓清指數較CY模型對照組升高(P<0.05)，MCP中、高劑量組小鼠的吞噬指數較CY模型對照組升高(P<0.05)。說明MCP對免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬作用有一定提升。

(a)小鼠廓清指數 (b)小鼠吞噬指數

3 討 論

在科學研究領域，CY常用于構建免疫功能低下或免疫功能抑制的動物模型。本研究以CY 80mg/kg連續3d腹腔注射構建免疫抑制小鼠模型，觀察到模型組小鼠體重減輕，脫毛現象明顯，與眾多文獻一致[10-11]。本研究結果表明CY模型對照組小鼠的WBC計數較正常對照組小鼠顯著下降(P<0.05)。WBC計數下降常見于病毒感染、自身免疫性疾病、急性白血病、藥物性骨髓抑制等，本研究表明致使WBC計數下降的原因是藥物性骨髓抑制劑CY的使用，說明本研究免疫功能抑制小鼠模型構建成功。

胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，兩者的發育狀況與機體免疫功能密切相關，所以通過胸腺指數與脾臟指數的大小能夠反映機體免疫功能的強弱[12]。本研究模型對照組小鼠的臟器指數較正常對照組明顯降低，差異有統計學意義，表明CY使小鼠胸腺和脾臟重量明顯減輕，與蔡帆等[13]研究相一致。MCP低劑量組小鼠臟器指數較模型對照組無統計學意義(P>0.05)，而MCP中、高劑量組小鼠臟器指數較模型對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，說明在運用MCP治療過程中，能在一定程度上糾正胸腺和脾臟萎縮，減輕CY對小鼠免疫器官的損害，但與正常小鼠相比仍有一定的差異，沒有完全恢復到正常狀態。

血清溶血素的變化可從分子水平反映機體體液免疫功能狀態。本研究表明MCP低、中劑量組小鼠溶血素水平較模型對照組略微升高，但無統計學意義(P>0.05)，MCP高劑量組小鼠溶血素水平較模型對照組升高，有統計學意義(P<0.05)，說明隨著MCP治療劑量的增加，小鼠的血清溶血素水平在逐漸提升，有一定量效相關性，故MCP可減輕CY對小鼠體液免疫功能的抑制作用，促使小鼠免疫功能逐漸恢復。

機體免疫功能分為特異性免疫和非特異性免疫，淋巴細胞可反映機體特異性免疫功能的狀態，而巨噬細胞的吞噬作用可反映機體非特異免疫功能的強弱。淋巴細胞增殖是特異性免疫激活的關鍵過程，脾臟中含有大量的淋巴細胞，因此，脾淋巴細胞增殖試驗是檢驗淋巴細胞活力的重要方法[14]。本研究結果表明模型組免疫抑制小鼠的脾淋巴細胞增值率低，在MCP以200mg/kg濃度治療下，可使小鼠脾淋巴細胞增值率恢復，說明MCP能夠有效刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖。巨噬細胞作為非特異性免疫重要一員，具有極強吞噬異物的特性。本研究結果顯示，高劑量的MCP能明顯提高免疫抑制小鼠的廓清指數和吞噬指數，故MCP可有效提高機體巨噬細胞的吞噬能力，增強免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能。

綜上，可認為MCP是一種免疫促進劑，它既能促進機體的體液免疫功能，又能增強特異性和非特異性免疫，從而有效地發揮免疫調節作用，具有一定的研究價值和開發前景。