雞柔嫩艾美耳球蟲抗體ELISA 檢測方法的建立

田崇瑜，段小超，陳彥華，霍乃蕊，韓克光，古少鵬，鄭明學

（1.山西農業大學動物醫學學院，山西太谷 030801；2.山西安弘檢測技術有限公司，山西太原 030008）

雞球蟲在養殖環境中普遍存在[1]并隨時可能形成循環感染[2]，嚴重危害養雞業。雞球蟲病由艾美爾屬球蟲寄生在腸上皮細胞引發，尤以寄生在盲腸的柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）致病性最強[3]。雞只攝入環境中的孢子化卵囊而感染，嚴重時引發雞只大批死亡，輕癥或痊愈雞生長發育受阻，對其他傳染病易感，產蛋率下降、料肉比增加，并且對新城疫、法氏囊、傳支等形成免疫抑制[4]。近年雞球蟲病呈現出一些新的變化[2]，表現出向小齡化發展、發病率和死亡率高、發病常年化、癥狀溫和、耐藥性增強、一般的消毒劑不起作用[5]等新的特征，給養雞業造成重大經濟損失[4]。

雞球蟲特異性抗體檢測技術將促進攻蟲后的抗體應答機制研究[6]和該病的免疫防控[7]。卵黃抗體防治雞球蟲病效果顯著[8]，是一種無藥物殘留、安全可靠、綠色環保的球蟲病防治新途徑[9]，雞球蟲抗體檢測技術的建立將有助于口服卵黃抗體制劑的研發[10]。

本研究以柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊接種雛雞制備陽性血清和可溶性抗原，優化最佳抗原包被濃度、包被條件、最佳血清稀釋度、酶標二抗工作濃度等，從而建立柔嫩艾美耳球蟲特異性抗體的ELISA 檢測技術，為相應試劑盒的研發奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試40 只5 日齡健康雛雞購自太谷某種雞廠。柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊、部分陽性血清及純化的柔嫩艾美耳球蟲特異性IgG（13.4 μg/mL），由山西農業大學鄭明學教授惠贈。

1.2 試劑與儀器

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、顯色劑TMB 和Tween-20 為Sigma 產品，標準品雞IgG 和兔抗雞IgG-HRP 購自北京博雅宏興科技發展有限公司。PBST 為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 值為7.4）中加入0.5 mL Tween-20 等。

UV-2000 紫外/ 可見分光光度計（Unico，美國）、JY92-2D 超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）和SpectraMax M5 多功能酶標儀（Molecular Devices，美國）等。

1.3 方法

1.3.1 柔嫩艾美耳球蟲陰性血清和陽性血清的制備 將40 只5 日齡健康雛雞在無球蟲環境中飼養，飲用水為涼白開，制備陰性和陽性血清前連續鏡檢糞便7 d，要求不能觀察到球蟲卵囊，采血制備20 份陰性血清。3 周齡無球蟲雛雞用柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊口服免疫，首免劑量為1×104個/羽，10 d 后二免，劑量為5×104個/羽，再隔7 d 三免，劑量為5×104個/羽。第三免7 d 后，強化免疫，劑量為5×104個/羽，7d 后采血，瓊脂擴散試驗測定抗體效價，達到1∶16 以上時大量采血[11]。大量采血前禁食12 h，將采的血放置于37 ℃1 h，然后置4 ℃30 min，取出后2 500 r/min 離心20 min，血清分裝后置于-20 ℃保存備用。

1.3.2 瓊脂擴散試驗檢測血清抗體 用0.01 mol/L PBS（pH 值7.4）制備1.5%的瓊脂糖凝膠，厚度為2.5～3.0 mm，凝固后梅花打孔器打孔，挑出孔中瓊脂，封底，中間孔加入柔嫩艾美耳球蟲可溶性抗原，外周孔1 加入已知陽性血清，新制備的陽性血清32、64、128 倍稀釋后依次加入孔2、孔3 和孔4，孔5 和孔6 加入制備的陰性血清。37 ℃濕盒中反應72 h，出現沉淀線為陽性，無沉淀線則為陰性。

1.3.3 柔嫩艾美耳球蟲可溶性抗原的制備 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊經超聲破碎后反復凍融處理，10 000 r/min 低溫高速離心30 min，收集上清液，用紫外分光光度計分別在260、280 nm 處測OD值，按公式（1）計算可溶性抗原含量（以蛋白質計）。

蛋白質含量（mg/mL）＝（1.45×OD280－0.74×OD260）×稀釋倍數 （1）

1.3.4 ELISA 操作流程 可溶性抗原包被酶標板并用3%BSA（pH 值7.4）封閉，加樣前血清用含1%BSA 的PBST 稀釋至不同濃度，同時設陰性和陽性對照孔，37 ℃孵育40 min；稀釋兔抗雞IgG-HRP 并加樣37 ℃孵育40 min；加TMB 工作液顯色，37 ℃避光反應30 min，用2 mol/LH2SO4終止反應，酶標儀測定各孔OD450。ELISA 過程中每步的加樣量為100 μL，每步操作前用PBST 洗板3 次，每次3 min。

1.3.5 酶標板均一性檢驗 隨機抽取8 條酶標板，測定各孔空白OD450值，用稀釋1 000 倍的酶標二抗4 ℃過夜包被酶標板，加底物避光顯色，終止反應，測定并計算各孔間的標準差和變異系數。

1.3.6 ELISA 反應條件的確定

1.3.6.1 酶標二抗工作濃度的確定 用質量濃度分別為1.25、1.20、1.15、1.00 μg/mL 的標準品雞IgG 包被反應板，用稀釋250、500、1 000 倍的兔抗雞酶標二抗分別與雞IgG 孔反應，每個組合做2 個平行，取能夠與最大稀釋度IgG 反應且OD450平均值為1.0 左右的最大酶標抗體稀釋度作為其工作濃度。

1.3.6.2 抗原最佳包被濃度和血清稀釋倍數的選擇

吸取20 μL 可溶性抗原（858.35 μg/mL）加入第1 孔，加180 μL0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）10 倍稀釋，以后各孔分別加稀釋液100 μL，從第1 孔吸取100μL加入第2 孔，反復吹吸后，吸取100μL加入第3 孔，依次操作，最后從第4 孔取100 μL 棄掉，4 ℃靜置12 h。將陽性血清和陰性血清分別進行10、20、40、80、100 倍稀釋，進行方陣ELISA，以陽性血清OD 值（P 值）與陰性血清OD 值（N 值）的比值（P/N 值）最大、陽性血清OD450接近1 的抗原最大稀釋倍數為抗原最佳稀釋濃度和血清最佳稀釋倍數。

1.3.6.3 包被液和包被條件的選擇 分別以0.01mol/L PBS（pH 值7.4）、0.05 mol/L Na2CO3-NaHCO3（CBS，pH 值9.6）、生理鹽水作包被液，抗原質量濃度為21.46 μg/mL，4 ℃包被12 h，陽性血清稀釋20 倍，酶標二抗稀釋500 倍，進行ELISA，測定OD450，選擇最佳包被液。

用0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）稀釋可溶性抗原至21.46 μg/mL，每孔加入100 μL 分別在以下條件進行包被：37 ℃/6 h、37 ℃/2 h、4 ℃/16 h、4 ℃/12 h，然后按1.3.4 進行ELISA，以抗原包被孔出現最大P/N 值時的包被條件最佳。

1.3.6.4 封閉時間的確定 每孔加100 μL 3%BSA，37 ℃分別封閉60、90、120、150 min，包被條件為4 ℃/16 h，其余操作同1.3.4，以P/N 值最大時所對應的封閉時間為最佳封閉時間。

1.3.7 陰、陽性臨界值的確定 抽取20 份陰性血清在上述確定的ELISA 條件下反應，計算OD450的平均值（x）和標準差（S），若樣品的OD450＞x＋3S，判定為陽性，若OD450＜x＋2S，則判定為陰性，中間值為可疑[12]。

1.3.8 標準曲線的繪制 以制備的可溶性抗原包被反應板，將純化柔嫩艾美耳球蟲特異性IgG（13.4 μg/mL）作為一抗并作1～14 倍稀釋，按照本研究確定的ELISA 條件反應，以OD450為橫坐標、特異性IgG 濃度為縱坐標，繪制標準曲線，并建立回歸方程。

1.4 數據分析

數據采用Excel 軟件處理并作圖。ELISA 反應結果OD450值以平均值±標準差表示，以P 值和N值的平均值計算P/N 值。

2 結果與分析

2.1 可溶性抗原含量的測定

所制備的可溶性抗原的OD280和OD260平均值分別為0.488 5 和0.308 5，按公式（1）計算，可溶性抗原中的蛋白含量為858.35 μg/mL。

2.2 陰性和陽性血清的檢測

由圖1 可知，陽性血清對照（孔1）和新制備的陽性血清（孔2）與柔嫩艾美耳球蟲可溶性抗原孔之間均出現了明顯的白色沉淀線，而陰性血清（孔5和孔6）則沒有，說明所制備的高免陽性血清和陰性血清均可用于后續ELISA 方法的建立。

2.3 酶標板均一性測定

經測定，酶標板的變異系數為1.52%，小于10%，表明該可拆開式聚苯乙烯酶標板符合ELISA 實驗的要求，可保證檢測結果的有效性和穩定性。

2.4 酶標二抗工作濃度的測定

從表1 可以看出，當酶標抗體稀釋500 倍時，與不同濃度的雞IgG 反應，OD450均接近1，故選用此稀釋倍數。

表1 不同稀釋倍數兔抗雞IgG-HRP 與雞IgG反應的ELISA 結果（OD450）

2.5 抗原包被濃度及血清稀釋倍數的確定

方陣ELISA 結果表明（表2），抗原包被質量濃度為21.46 μg/mL，血清稀釋倍數為20 時，P 值接近1，且P/N 值也較高，故選擇稀釋20 倍作為ELISA反應的血清稀釋倍數。

表2 不同抗原包被濃度與不同稀釋倍數血清的方陣ELISA 結果（OD450）

2.6 包被液和包被條件的選擇

從表3 可以看出，用PBS 和生理鹽水作為包被液，OD 值僅為碳酸鹽緩沖液的1/3，而空白對照孔OD 值基本一致。因此，選擇0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）為包被液。

表3 不同包被液的ELISA 結果（OD450）

以0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）作包被液，由表4 可知，在不同的溫度和時間下，N 值變化不大，4 ℃包被16 h 時，P 值接近1，且P/N 值最大，所以，選擇的最佳包被條件為4 ℃放置16 h。

表4 抗原最適包被溫度和時間的確定（OD450）

2.7 封閉時間的確定

由表5 可知，P 值接近1，且P/N 值最大時所對應的封閉時間為120 min。

表5 封閉不同時間的ELISA 檢測結果（OD450）

2.8 陰、陽性臨界值的確定

經測定和計算，20 份陰性血清樣品的OD450平均值（）為0.108，標準差（S）為0.006 5，如果OD450＞0.127 5（+3S），結果判為陽性；如果OD450＜0.121（+3S），結果判為陰性，中間值為可疑。

2.9 標準曲線的繪制

以柔嫩艾美耳球蟲特異性IgG 建立的標準曲線（圖2）可知，在0.007～13.4 μg/mL 范圍內，柔嫩艾美耳球蟲特異性IgG 含量（y）與OD450（x）的關系為：y＝5.151 8x2－4.763 4x＋1.004 4，相關系數為0.992 1。

3 結論與討論

柔嫩艾美耳球蟲是雞球蟲病中最常見的一種，其突出特點是致病性強而免疫原性弱[13]，所以，一旦雞群對柔嫩艾美耳球蟲產生了保護力，就可判定對其他蟲株也產生了保護作用，這也是本研究以柔嫩艾美耳球蟲為研究對象，建立其特異性IgG ELISA 檢測方法的原因，一方面可為球蟲疫苗免疫效力評價提供有效監測手段，另一方面也有利于研究球蟲的體液免疫應答機制。IgG 在球蟲免疫中發揮著重要作用[13]，檢測球蟲抗體的方法有瓊脂糖擴散法和Dot-ELISA[14]，但這2 種方法不能對IgG 精確定量。ELISA 檢測方法是一種具有高靈敏度的定量分析技術。學者們分別以原核表達的雞柔嫩艾美耳球蟲重組蛋白例如微線體蛋白4[12]、λMzp5-7 蛋白[11]等作為包被抗原建立ELISA 檢測方法，雖然包被抗原易制，但在實際檢測中需要去除待檢血清中的大腸桿菌抗體，否則易出現假陽性結果。還有人用減毒蟲株[15]的可溶性卵囊抗原以及直接以弱毒四價活疫苗[6]等作為包被抗原建立ELISA 檢測方法，每種建立的方法包被抗原濃度、包被緩沖液、封閉液及封閉時間、血清稀釋度和酶標抗體的工作濃度等參數都有所不同，所使用的酶標二抗也不盡一樣。

本試驗研究結果采用陰性血清OD450平均值加3 倍標準差（0.127 5）作為陽性血清的臨界值，陰性臨界值為OD450平均值加2 倍標準差（0.121），置信度為99%，即高于0.127 5 和低于0.121 為陽性血清和陰性血清的可能性為99%[16-18]。

本研究建立了雞柔嫩艾美耳球蟲抗體的ELISA 檢測方法，以0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）稀釋可溶性抗原至21.46 μg/mL，4 ℃包被16 h；3%牛血清白蛋白37 ℃封閉2 h；待檢血清和兔抗雞IgG-HRP 的最佳稀釋倍數分別為20 倍和500 倍，陰性和陽性結果判定的臨界OD450值分別為0.127 5 和0.121。該方法的建立有助于相應檢測試劑盒的研發并可促進雞球蟲病的有效防控。