谷子PHR 家族基因的生物信息學及表達模式分析

吳年隆，舒 軍，王嘯旗，張 銀，韓淵懷，趙雄偉，楊致榮

（1.山西農業大學基礎部，山西太谷 030801；2.山西農業大學生命科學學院，山西太谷 030801；3.山西農業大學農學院，山西太谷 030801）

磷（P）是植物生長、發育和代謝所必需的礦質營養元素之一[1]，植物主要通過根系從土壤溶液中吸收無機磷[2]。然而，磷在酸性和堿性土壤中磷易與鐵、鈣、鋁等離子反應，生成難溶性磷[3]，不利于植物吸收和同化。在農作物的農業生產中，需過量施用磷肥以彌補土壤中有效磷，但此過程會造成嚴重的環境污染。因此，利用分子生物學手段挖掘解析植物磷高效利用的分子機制，對磷缺乏土壤的可持續農業生產具有重要意義。

植物為了適應低磷生態環境，進化出一套復雜的基因調控網絡，其中與磷酸鹽吸收轉運相關成員中最重要的有PHR1（Phosphate Starvation Response1）、IPS1（Induced by Phosphate Starvation1）、miR399（microRNA399）、PHO2（Phosphate2）和PT（Phosphate Transport）[4-5]。在這個復雜的調控網絡中，PHR 蛋白是植物磷調控網絡中的重要轉錄因子，在磷酸鹽饑餓誘導下起著重要的信號轉導調控作用[6]。目前，擬南芥、水稻、玉米等多個物種已在相應的全基因組水平上鑒定了PHR 家族基因[7-9]，其中，擬南芥的AtPHR1 基因功能缺失會重塑膜脂代謝、初級代謝和次生代謝以及光合作用等，從而影響到擬南芥根冠的生長速率和花青素的積累等生理過程[10]；水稻中含有MYB-CC 型結構域的基因OsPHR1、OsPHR2 和OsPHR3，其中任意一個基因功能的缺失都會抑制水稻根毛的伸長[4]，進而影響植物對磷酸鹽的有效吸收。

谷子（Setaria italica，2n＝18）是起源于我國的一個古老作物，廣泛栽培于歐亞大陸的溫帶和熱帶地區[11]，具有突出的抗旱、耐瘠薄和高光效等特性，已發展為旱生C4 禾谷類模式作物[12]。為了挖掘谷子耐低磷的優異基因，本研究基于已經公布的谷子全基因組序列[13]，利用生物信息學方法鑒定了谷子基因組中PHR 基因家族成員，并對其基因結構、順式作用元件、基因表達模式等進行了分析，以進一步探究谷子、水稻、高粱、玉米和擬南芥PHR 基因家族的進化關系，為谷子PHR 基因的耐低磷調控網絡研究提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 谷子PHR 基因家族成員的鑒定及其蛋白理化性質分析

以功能已知的水稻OsPHR1[4]轉錄因子的蛋白序列為靶標序列，在水稻基因組中進行同源序列比對（同源性P＜10e-10），得到水稻所有OsPHR 基因后，在利用hmmbuild 軟件對檢索到的水稻OsPHR基因建立HMM 模型[14]，然后在谷子基因組數據中搜索同源基因，下載谷子PHR 家族基因的蛋白序列和編碼序列。利用在線網站Pfam（http://pfam.xfam.org/）進行結構域分析，手動去除不含MYB-CC 結構域的序列。最后利用在線網站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析谷子SiPHR 基因的分子量、氨基酸長度和等電點等蛋白理化性質。

1.2 SiPHR 基因家族成員的系統進化關系分析

從Phytozome 數據庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）PHR 家族基因的蛋白序列，從NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載玉米（Zea mays）的PHR家族基因的蛋白序列。利用MEGA 7.0 軟件[15]對谷子、水稻、高粱、玉米和擬南芥的PHR 家族基因的蛋白序列進行同源多序列比對，并采用鄰接法（NJ）構建系統發育樹，Bootstrap 值為1 000。

1.3 SiPHR 基因家族成員的保守結構域和基因結構分析

使用在線網站MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）預測SiPHR 基因的保守基序，Motif（基序）數設置為10 個，并使用在線網站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）預測Motif 的類型；最后，基于谷子基因組注釋，在TBtools 軟件[16]上繪制基因結構。

1.4 SiPHR 基因家族成員的啟動子順式作用元件分析

啟動子在調控基因的轉錄和表達方面有著重要的作用。為了了解谷子SiPHR 基因可能存在的調控和響應機制，在Phytozome 數據庫上下載谷子PHR 家族各基因上游1 500 bp 的基因組序列，然后遞交至PlantCARE 在線網站上（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），并進行啟動子順式作用元件分析，最后使用TBtools 軟件[16]進行可視化操作。

1.5 SiPHR 基因家族成員的組織表達分析

根據Phytozome 數據庫（https://phytozome.jgi.doe.gov）下載谷子PHR 基因轉錄組數據，分別對葉、芽、穗和根中基因表達進行分析。利用Heatmapper（http://www2.heatmapper.ca/）在線網站繪制熱圖。

1.6 低磷脅迫下根中SiPHR 基因家族成員的差異表達分析

為了進一步篩選根中響應低磷誘導的SiPHR基因，本研究采用實時熒光定量方法（qRT-PCR）檢測SiPHR 基因在低磷條件下的表達量。從前期研究中篩選出來的耐低磷品種B376[17]，使用水培法[18]對萌發10 d 谷子幼苗進行培養，每4 d 更換一次營養液，溫度為28 ℃，相對濕度為50%左右，光照強度30 000 lx，光周期為14 h/10 h（光/暗），正常磷濃度設置為0.25 mmol/L。之后將正常生長21 d 的幼苗進行低磷（磷濃度為0.005 mmol/L）脅迫處理，在第0、1、3、5 天剪取谷子的根系，沖洗干凈后保存在-80 ℃中備用。

利用Trizol 法提取不同脅迫時間下谷子根部樣品的總RNA，按照Primer Script RT reagent Kit（Takara）試劑盒說明書對提取到的谷子根部RNA進行反轉錄，得到cDNA。利用Primer 6.0 和DNAMAN 軟件設計SiPHR 基因家族成員PCR 引物（表1）。以SYBR Green 為顏料進行qRT-PCR。15 μL 反應體系包括：2×Taq PCR Master Mix（含熒光染料）7.5 μL、引物10 μmol/L 各0.6 μL、ddH2O 3.3 μL 和cDNA 模板3 μL。反應條件為：95 ℃2 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環；4 ℃10 min 保存。

以谷子Actin 基因（Si9g37480）為內參（F：5′-ATGGCCACCAAGCAAACT-3′，R：5′-GGATCTCAC GGAGGGCAACAG T-3′），根據2-ΔΔCt計算SiPHR 基因家族成員的相對表達量。以0 d 為對照組，采用t檢驗法分析不同低磷脅迫時期的SiPHR 基因表達量的顯著性。

表1 SiPHR 實時熒光定量PCR 分析引物

2 結果與分析

2.1 SiPHR 基因家族的鑒定及其理化性質分析

以功能已知的OsPHR 蛋白序列為靶序列，利用HMM 模型的同源比對方法從谷子基因組中共鑒定出16 個SiPHR 候選基因。根據谷子PHR 基因家族成員與擬南芥AtPHR1 基因序列的相似性，由近到遠分別命名為SiPHR1～SiPHR16（表2）。

表2 谷子PHR 基因家族成員基本信息

16 個SiPHR 基因分布在7 條染色體上，其中，2 號染色體上分布有4 個；1 號染色體上分布有3個；3 號、4 號、6 號和9 號染色體上各分布2 個；7 號染色體上有1 個SiPHR 基因。16 個SiPHR 基因的編碼序列長度在0.7～1.5 kb，編碼的氨基酸數量在260～473 個。蛋白的分子量在27.92～51.80 ku；其中7 個SiPHR 蛋白的等電點大于7，呈堿性，9 個SiPHR 蛋白的等電點小于7，呈酸性。SiPHR 蛋白的平均疏水性系數都為負數，均為親水性蛋白。

2.2 SiPHR 基因家族成員系統進化分析

為了研究谷子PHR 基因家族的系統進化關系，將16 個谷子SiPHR 蛋白序列與18 個水稻Os-PHR 蛋白序列、18 個玉米ZmPHR 蛋白序列、16 個高粱SbPHR 蛋白序列和14 個擬南芥AtPHR 蛋白序列進行比對，并構建系統發育樹如圖1 所示，將SiPHR 家族成員劃分為5 個亞組（ClassⅠ～ClassⅤ）。其中，ClassⅠ有5 個SiPHR 蛋白成員，包括SiPHR1、SiPHR2、SiPHR3、SiPHR4 和SiPHR12；Class Ⅱ和Class Ⅲ均含有2 個成員，分別為SiPHR10 和SiPHR13、SiPHR11 和SiPHR14；ClassⅣ有3 個成員，分別為SiPHR5、SiPHR6 和SiPHR16；ClassⅤ有4 個成員，分別為SiPHR7、SiPHR8、SiPHR9、SiPHR15。

從5 個亞組的聚類情況可以看出，谷子與水稻、玉米和高粱聚在一起，且基本都是成組出現，即每個SiHPR 分別對應水稻、高粱和玉米的1～3 個PHR 同源蛋白。其中，SiPHR5、SiPHR6、SiPHR7、SiPHR8、SiPHR9、SiPHR11、SiPHR13、SiPHR14 分別對應1 個水稻、高粱和玉米PHR 蛋白；SiPHR1、SiPHR2、SiPHR4、SiPHR12、SiPHR16、SiPHR15 對應2 個水稻、高粱和玉米PHR 蛋白；而SiPHR3、SiPHR10 對應3 個水稻、高粱和玉米PHR 蛋白。值得注意的是，SiPHR4 與SiPHR13 分別由SiPHR3與SiPHR10 進化而來。此外，不論在哪個亞組中，擬南芥AtPHR 總是單獨聚在一個分支。結果表明，谷子SiPHR 與水稻OsPHR、高粱SbPHR、玉米ZmPHR的親緣關系明顯近于與擬南芥AtPHR 的親緣關系。因為谷子、水稻、高粱、玉米是單子葉植物，而擬南芥屬于雙子葉植物，推測這些單雙子葉進化時PHR基因在不同植物綱中發生了生物功能上的分化。

2.3 SiPHR 基因家族成員保守結構域和基因結構分析

對SiPHR 基因家族成員保守結構域的分析結果顯示（圖2-a），所有SiPHR 蛋白中都存在Myb_DNA-binding 和Myb_CC_LHEQLE，而其他Motif 均為功能未知基序，這還有待進一步研究。其中，Motif 3 存在ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ亞組中，Motif 6為ClassⅡ亞組特有，Motif 8 和Motif 10 為ClassⅢ亞組特有，Motif 9 為ClassⅣ亞組的2 個SiPHR 特有。值得注意的是，ClassⅤ的SiPHR 蛋白基序類型有所差異，其中，SiPHR3 和SiPHR4 存在4 種Motif，而SiPHR1 和SiPHR2 存在3 種Motif，SiPHR12只含有2 種Motif。這些特殊保守基序可能是不同的SiPHR 參與不同生物學功能的主要因素。

SiPHR 基因家族成員進行基因結構分析發現（圖2-b），同一亞組的PHR 成員基因結構類似，不同亞組間PHR 成員的外顯子數差異不大。除ClassⅠ的SiPHR9 基因和ClassⅤ的SiPHR 基因均含有7 個外顯子外，其他SiPHR 基因均含有6 個外顯子。

2.4 SiPHR 基因家族成員的啟動子順式作用元件分析

為進一步闡明谷子PHR 家族基因在非生物脅迫中可能存在的調控機制，利用PlantCARE 數據庫對啟動子序列進行了分析，結果如圖3 所示，共鑒定出9 類順式作用元件，包括光響應、干旱誘導、茉莉酸甲酯、厭氧誘導、脫落酸、抗逆、赤霉素、低溫、生長素順式作用元件；從組成數量上看，SiPHR 基因平均含有4.8 個順式作用元件，均包含光響應元件，其中，SiPHR11 和SiPHR14 包含的響應元件種類最多（7 種），而SiPHR16、SiPHR3 和SiPHR5 包含的順式響應元件最少（2～3 種）；從組成類型特異性來看，含有低溫響應元件的基因有SiPHR4、SiPHR8、SiPHR11 和SiPHR13，含有干旱或茉莉酸甲酯響應元件的基因有SiPHR3、SiPHR5 和SiPHR13，含有生長素響應元件的基因有SiPHR3、SiPHR4、SiPHR11、SiPHR12 和SiPHR13。ClassⅠ、ClassⅡ中除SiPHR8 外其他SiPHR 基因均包含脫落酸，而ClassⅢ、ClassⅣ和ClassⅤ的大部分基因不包括脫落酸，但含有大量的生長素和赤霉素響應順式作用元件。結果表明，SiPHR 基因的表達不僅受到光誘導的調節，而且在干旱、澇漬（厭氧）等抗逆脅迫中也發揮著作用。其中，SiPHR3、SiPHR5 和SiPHR16 啟動子區包含順式元件較少，僅與光、赤霉素和生長素、厭氧誘導作用有關。

2.5 SiPHR 家族基因的組織表達分析

通過對SiPHR 基因組織表達進行分析發現，除SiPHR9 外，其余15 個SiPHR 基因在葉、芽、穗和根中均有一定的表達（圖4）。其中，SiPHR2、SiPHR8和SiPHR10 在4 個組織中均高表達（FPKM均大于13），表明這3 個基因在谷子的各個形態建成方面都發揮了重要作用；SiPHR3 在根中高表達，而SiPHR4 在根中表達量最低；SiPHR6 和SiPHR16 在葉片中有較高表達，結合SiPHR16 啟動子順式元件結構推測，其可能在葉片的光合作用中發揮著重要的作用；SiPHR1 在穗中有較高的表達，其余7 個基因 SiPHR5、SiPHR7、SiPHR11、SiPHR12、SiPHR13、SiPHR14 和SiPHR16 在葉、芽、穗和根中的表達量都較低。由此表明，SiPHR 基因在谷子的各個組織中都發揮了作用，其中，SiPHR1、SiPHR3、SiPHR4、SiPHR6 和SiPHR16 具有明顯的組織表達特異性。

2.6 在低磷脅迫條件下的根中SiPHR 基因的表達模式分析

對低磷脅迫后根系的16 個SiPHR 基因進行差異表達分析顯示，除SiPHR7 和SiPHR9 未檢測到外，其余SiPHR 基因在低磷處理后，表達量都受到了一定程度的影響（圖5），SiPHR1 和SiPHR15 的表達在低磷脅迫后都明顯被抑制；SiPHR2、SiPHR4、SiPHR5、SiPHR6、SiPHR8、SiPHR11、SiPHR12 和SiPHR14 在低磷脅迫后表達量持續上升，其中，SiPHR4、SiPHR6、SiPHR11 和SiPHR12 都恢復或超過脅迫前水平。此外，SiPHR3、SiPHR10、SiPHR13、SiPHR16 在低磷脅迫后呈現先上升后下降的趨勢。值得注意的是，SiPHR3 的表達量在脅迫后3 d 顯著高于脅迫前水平，SiPHR10 的表達量在脅迫后1 d顯著高于脅迫前水平，SiPHR16 在低磷脅迫3 d 的表達也恢復到脅迫前的水平。

3 結論與討論

磷是植物生長發育所必需的營養元素，約占干質量的0.2%。磷缺乏是限制作物產量的一個主要因素，植物已進化出一系列的形態、生理和分子策略來適應磷缺乏的癥狀[19]，這些策略大多數都是通過增強土壤中磷的流動性或者根系對磷的獲取，從而提高對磷的利用效率。近年來，調控低磷脅迫的相關基因和蛋白已被陸續發現和鑒定，其中，PHR是一種MYB 型轉錄因子，在植物磷饑餓反應中起著至關重要的調節作用[20-22]。已有報道，PHR1 和PHR1類基因在擬南芥[23]、水稻[4]、豆類[24]、小麥[20]、玉米[25]和油菜[26]等植物的磷信號調控網絡中起著關鍵作用。此外，擬南芥和水稻的全基因組轉錄分析表明，大多數磷饑餓響應基因都是被AtPHR1 和OsPHR2 以及其同源基因AtPHL1、AtPHL2、OsPHR1 和OsPHR3誘導而激活[4，27-28]。本研究通過生物信息學的方法共鑒定出16 個谷子PHR 基因，其數量與擬南芥（15 個）、水稻（12 個）、玉米（18 個）和高粱（16 個）相當[29]。但在前人報道中，大豆基因組中存在35 個PHR 基因[24]，與本研究數量相差較大的原因除與染色體數目和基因組大小有關外，還與大豆會產生根瘤菌、需要更多的轉錄因子來促進氮磷協同吸收有關。

對谷子與水稻、玉米、高粱和擬南芥的親緣關系進行鑒定，16 個SiPHR 蛋白被分為5 個亞組，每個SiHPR 分別對應水稻、玉米和高粱的1～3 個PHR 同源蛋白，主要原因可能是谷子和水稻、玉米、高粱同為單子葉作物，而擬南芥為雙子葉作物。此外，谷子SiPHR4 與SiPHR13 分別由SiPHR3 與SiPHR10 進化而來。基因結構分析SiPHR 基因均含有MYB-CC 和Myb_DNA-binding 保守結構域，與擬南芥中PHR 基因家族的結構域特征相同[30]。順式作用元件通過響應不同的外界信號來調節基因轉錄過程，進而影響植物的生長發育[31]。已有研究發現，磷酸化信號轉導和磷饑餓響應受光、糖、植物激素（生長素、乙烯、細胞分裂素和赤霉素）以及氧和影響[32-35]。如擬南芥中，AtPHR1 的表達會受到光和乙烯的協同調節，且通過AtPHR 基因的啟動子實現對磷饑餓響應的調控[36]。本研究中，SiPHR 基因啟動子中共鑒定出了9 類順式作用元件，大量的光響應元件和激素類元件表明，SiPHR 基因的表達和調控受光和激素的影響。

已有報道發現，玉米、水稻和高粱大多數PHR基因在所有組織中均有連續表達，表明它們可能在調節磷攝取和轉運方面起著重要作用[4，28，31]。本研究對谷子PHR 家族基因在葉、芽、穗和根中的組織表達進行了分析，發現谷子PHR 家族基因存在組織特異性表達，這與其他禾本科作物PHR 基因的表達情況相似[29]。在組織表達分析中發現，SiPHR3 在根中的表達量極高（FPKM 為37.64），在啟動子順式作用元件中含有與抗逆有關的赤霉素和生長素類響應元件。此外，SiPHR3 在低磷脅迫后第3 天時表達量遠遠超過了脅迫前的表達水平，故推測SiPHR3 可能與非生物逆境下重塑根部形態有關。

綜上所述，本研究在谷子基因組中鑒定了16 個SiPHR 基因，這些基因的氨基酸數量和等電點特性存在很大的差異。此外，SiPHR 在啟動子區存在大量的光響應、生物和非生物脅迫（低溫、澇漬、干旱等）相關的順式作用元件。進一步對低磷脅迫后根中SiPHR 基因差異表達分析發現，SiPHR3 和SiPHR10在低磷處理3 d 后顯著高表達，此研究將為后續SiPHR 基因的功能研究和谷子新品種選育奠定一定基礎。