長期放射性環境下微生物群落多樣性變化

安毅夫,孫 娟,高 揚,連國璽,楊 冰 (中核第四研究設計工程有限公司,河北 石家莊 050021)

鈾尾渣作為鈾礦采冶產生的主要固體廢物,其不僅含有U、226Ra、210Pb、210Po 等天然放射性核素,也包括水冶加工工藝帶入的酸、堿、有機物等多種化工物料,在降水淋濾和地表徑流的作用下[1],導致污染物的溶出和遷移,可能造成潛在的環境污染風險.

微生物是生態環境的重要參與者,對地質構造、物質循環和生態穩定等多個過程均有貢獻[2-4],然而,人類活動導致的污染物遷移,會改變微生物生存場所的pH 值、無機離子、有機質等環境因子,抑制了微生物群落的可持續增長,降低了環境自凈容量,從而加速污染物的累積.研究微生物群落隨環境因子的變化規律,有利于掌握微生物群落在不同污染物水平下的種群協同作用機制[5].目前,高通量測序技術作為分析微生物群落結構和多樣性的有效手段[6],被廣泛用于生態環境領域,不過由于采樣手段的限制,大多數研究多集中于土壤表層[7]、河道沉積物[8]、地表水體[9]等表層介質,對于尾礦庫、尾渣庫等具有深層結構的微生物群落研究較少.

隨著時間尺度的延長和雨水的持續搬運,鈾尾渣庫中放射性核素、重金屬離子等成分易發生垂向遷移,可能導致不同深度的微生物群落發生顯著性結構變化[10-12],而且鈾尾渣具有比環境土壤樣品更大的孔隙度、滲透系數及更多的放射性核素和重金屬元素,理論上極大影響了深層鈾尾渣中微生物的代謝途徑及對放射性核素和重金屬的耐受性[13].

因此,本研究通過對鈾尾渣庫的鉆井取樣,以不同深度的微生物群落分布特性分析長期放射性環境下的微生物群落多樣性變化,揭示微生物與庫區內部環境變化的相關關系,為放射性環境下潛在修復功能菌種的選育提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣工作開展于某鈾尾渣庫及周邊土壤,該鈾尾渣庫始建于2004 年,所屬地區為亞熱帶濕潤氣候,多年平均降雨量為1500～2200mm.鉆井施工時,以鈾尾渣庫灘面開展垂直鉆井作業,鉆井施工點位布設如圖1 所示,靠近壩體為ZK1,采用逆時針方向編號ZK2、ZK3、ZK4,中心點位鉆井為ZK5,共5 個點位.

取樣時,為防止表面受自然沉降雜質影響,去除0～40cm 的表層鈾尾渣,將距離表層40～60cm 處樣品列為表層樣品,其余部分以每5m 取1 次樣品,按深度分別編號為Dep-0、Dep-5、Dep-10、Dep-15 和BOT 組.作為對照,采集尾渣庫周邊10～20m 處土壤樣品作為環境特征樣品,編號Environs.所有采集樣品以無菌密封袋冷藏避光保存,分別進行理化特征的測試和微生物群落的分析.

圖1 鈾尾渣庫采樣分布示意Fig.1 Sampling distribution diagram in the dry uranium tailing pond

1.2 理化特性分析

通過前期調研,鈾尾渣樣品中主要成分包括放射性核素(U、226Ra、210Po、210Pb),金屬元素(Mn、Fe、Ca)和土壤有機質(SOM)等.開展理化性質分析時,放射性核素U 和金屬元素Mn、Ca、Fe 采用三酸消化法消解后用ICP-MS 測定得到物態全量[14],226Ra 采用硫酸鋇共沉淀法測定[15],210Po 和210Pb 采用總α 計數法[16],pH 值采用電極電位法[17],SO42-采用浸提后離子色譜法測定[17],有機質采用重鉻酸鉀容量法[17].鈾尾渣樣品的主要成分含量見表1.

表1 不同深度鈾尾渣樣品主要成分含量Table 1 The main contents in uranium tailings at different depths

1.3 DNA 提取與PCR 擴增

鈾尾渣樣品以E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒提取基因組DNA[18],以提取的基因組DNA 為模板,本實驗中采用兩步PCR 法(two-stage PCR)進行擴增建庫,第一輪PCR 采用16S 的V3-V4區引物(341F “CCTACGGGNGGCWGCAG”與805R“GACTACHVGGGTATCTAATCC”), 反 應 體 系 為2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15μL, Bar-PCR primer F 1μL, Primer R 1μL, PCR products 10～20ng,H2O 9～12μL,總體積30μL.反應條件為:初始94℃3min,然后以94℃ 30s,45℃ 20s,65℃ 30s 重復5 次,之后再以94℃ 20s,55℃ 20s,72℃ 30s 重復20 次,最后以72℃ 5min 后冷卻得到第一輪PCR 擴增結果;第二輪引入Illumina 橋式PCR 兼容引物,反應體系為2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15μL, Primer F 1μL,Index-PCR Primer R 1μL,PCR products 20～30μL,H2O 9～12μL,總體積30μL.反應條件為:初始95℃ 3min,然后以94℃ 30s,55℃ 20s,72℃ 30s 重復5次,最后以72℃ 5min 后冷卻得到第二輪PCR 擴增結果,完成兩輪PCR 后,以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小,采用Qubit3.0 熒光定量儀進行文庫濃度測定并回收混合產物,從而完成建庫過程.將以上檢測合格后的文庫在Illumina MiSeq 平臺進行高通量測序.

1.4 統計分析

本次分析數據分別將同一點位或同一深度的結果聚類,利用Office Excel 2013 軟件進行統計.基因序列的分析主要包括:將測序結果在QIIME 平臺上去除低質量序列,根據標簽序列區分不同樣品的序列[19].通過Uchime軟件去除PCR過程中形成的嵌合體[20],將收集的高質量序列用Usearch方法進行聚類[21],以基因序列97%相似度作為分類操作單元OTUs 的劃分標準.方差分析(ANOVA)、Pearson 相關性分析用SPSS Statistics 22.0 軟件完成.采用R 軟件(版本4.0.0)中的多個數據包來完成花瓣圖、PcoA、RDA 等分析和繪圖[21].

2 結果與分析

2.1 鈾尾渣庫區群落微生物多樣性特征

花瓣圖(圖2)反映了鈾尾渣樣品在OTU 水平上的特異性和相似性情況[22].OTU 水平上尾渣與環境土壤差異性顯著,不同樣品中僅有52 個OTU 相同,占總量的0.58%～7.36%,而特異性OTU 數量呈現Environs＞ZK1＞ZK2＞ZK4＞ZK3＞ZK5,其中,ZK5 在總量上僅為Environs 的7.87%.

生態學指數Shannon、Chao1、ACE 和Coverage能夠共同表征樣品微生物多樣性和數據準確性[23],其中Shannon 指數反映OTU 水平上的物種多樣性,Chao1 和ACE 指數表征物種豐富度,Coverage 指數則是對多樣性數據的檢驗.表2 中環境組的多項指數均大于鈾尾渣樣品,其中,環境樣品與鈾尾渣樣品的Shannon 指數組間差異顯著(P＜0.05),Chao1 和ACE 指數分別是鈾尾渣樣品的 1.82～7.94 倍和1.82～6.57 倍,通過Coverage 指數對OTU 的有效性進行驗證,所有樣品的Coverage 指數均大于或等于0.97,說明本次測序結果是科學可靠的.

圖2 微生物群落OTU 分布花瓣Fig.2 Flower plot diagram of OTU diversity of microbial community

表2 鈾尾渣微生物群落多樣性信息Table 2 Microbial community diversity in uranium tailings

圖3 微生物群落多樣性PCoA 分析Fig.3 PCoA analysis of microbial community diversity

基于Bray-Curtis距離的PCoA主坐標分析反映了鈾尾渣樣品組間微生物群落的β-多樣性差異.結果如圖3 所示,微生物群落組成共有75.10%在一維和二維尺度上表達,基本達到解譯的完整性.點位的離散程度代表微生物群落樣品間的β-多樣性差異,兩點間距離越長則差異越顯著,結果顯示,表層鈾尾渣與環境組的微生物多樣性相似程度較高,而底層鈾尾渣與其他樣品的多樣性差異較明顯.

2.2 鈾尾渣庫內微生物群落分布特征

除去環境土壤樣品外,鈾尾渣樣品中共發現0.01%豐度以上共34 門,總體上優勢菌群(豐度＞5%)包括變形菌門Proteobacteria(52.51%)、厚壁菌門Firmicutes(15.96%) 、 放 線 菌 門 Actinobacteria(9.57%)、擬桿菌門Bacteroidetes(6.11%),占總量的84.15%,酸桿菌門Acidobacteria(4.49%)和綠彎菌門Chloroflexi(1.57%)為次優勢菌群(豐度＞1%)(圖4).

圖4 顯示了不同深度下豐度占比排列前20 位的微生物群落門水平分布情況,Proteobacteria 在不同深度的鈾尾渣樣品中均為占比最大的優勢菌群,豐度范圍在36.11%～64.62%,值得注意的是,在長期放射性環境下(5m～底層),Actinobacteria 的豐度從4.44%連續增加至9.07%.

圖4 門水平上的物種分布差異Fig.4 Species distribution differences at the phylum level

屬水平上,所有鈾尾渣樣品中的菌群種類超過500 屬.總體上來說,豐度超過5%的優勢菌群主要有苯基桿菌屬 Phenylobacterium(8.98%)和梭菌屬Clostridium (5.14%)兩類,其余菌群豐度分布較為分散,豐度小于1%的菌屬總占比為64.37%.圖5列出了不同深度下豐度占比排列前20 位的微生物群落屬水平分布情況,對于表層鈾尾渣,鞘脂菌屬Sphingosinicella、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas 和酸桿菌屬Gp1 為優勢菌種,除表層外,Phenylobacterium和Clostridium 均為各個深度的優勢菌群,另外,在長期放射性環境下(5m～底層),隨深度增加時節桿菌屬Arthrobacter 的豐度從0.92%連續升至4.59%、酸桿菌屬Gp16 的豐度從0.04%連續升至4.08%.

圖5 屬水平上的物種分布差異Fig.5 Species distribution differences at the genus level

2.3 環境因子對微生物群落的影響

將深度≥5m 的長期放射性環境下的微生物群落(豐度＞1%)與環境因子之間開展RDA 分析,結果如圖6 所示,Ca、210Po 和210Pb 是本研究中對微生物群落作用最大的環境因子,其次是SO42-、pH 值和U等.微生物群落與環境因子正相關表明微生物群落能夠有效適應該條件變化,而負相關則說明微生物群落很難在該條件下有效繁殖[24].鈾尾渣樣品中,Ca、210Po、210Pb、U、SO42-均與Proteobateria 和Bacteroidetes 顯著正相關,Fe 和226Ra 與Firmicutes顯著正相關,Mn 與Chloroflexi、Acidobacteria 和浮霉菌門 Planctomycetes 顯著正相關, 但與Proteobateria 和Bacteroidetes 顯著負相關,pH 值、SOM 與Actinobacteria 顯著正相關.

圖6 環境因子與微生物群落的RDA 冗余分析Fig.6 RDA analysis of environmental factors and microbial community

3 討論

3.1 鈾尾渣理化性質特征

鈾尾渣的理化特性均呈現表層樣品中放射性核素和重金屬離子較高,深層鈾尾渣相對較低的特征,這可能與鈾尾渣堆置時間以及采用石灰中和法進行表層原位固定有關[25].本研究中,鈾尾渣的取樣深度與堆置時間呈正相關,表層尾渣堆置時間較短,而最深處尾渣距今約15a.新堆置的尾渣受到自然環境,特別是降雨的影響較少,而投加石灰為表層鈾尾渣增加了大量OH-,中和了酸浸過程中殘余的酸性物質,并且以包裹形式將大部分U、Mn 等元素含量固定于鈾尾渣表面.但是,隨深度增加,堆置時間較長的深層尾渣中,石灰的固定化作用減弱,離子的可遷移性增加,導致礦渣中U、226Ra、210Po、210Pb、Mn、Fe 等元素從鈾尾渣表面被釋放.Yin 等[26]報道在長期的酸雨淋濾中,尾礦渣表層的礦物溶解可能會導致放射性核素和重金屬元素的垂向遷移,造成深層污染物富集,在降雨頻繁的春夏季節,這種情況可能被進一步加劇[27].

3.2 微生物群落多樣性變化分析

風化作用和石灰乳中和等因素對微生物多樣性的影響較大[28],表層鈾尾渣中物種β-多樣性與深層鈾尾渣出現了顯著差異(圖3),在表層中占比超過1%的candidate division WPS-2(2.03%)、糖化細菌門Candidatus Saccharibacteria(1.88%)在底層多個點位中均不足0.01%,Xue 等[29]通過對酸性土壤投加石灰的研究表明激增的OH-會迅速改變微生物群落結構,進而實現原位處理的酸性土壤改良.然而,在長期放射性環境下,隨著重力牽引導致的環境因子垂向遷移過程中,雖然整體上呈現越深層物種豐富度越低的特點,但是特定種屬的微生物由于適應性強從而可能發生物種豐度的增加,例如Arthrobacter 和Gp16 的豐度從5m 至底層連續上升,這體現了該類微生物對環境變化的較強適應性[30].

本研究中Proteobacteria 在不同深度鈾尾渣中均為占比最高的優勢生物,該菌群作為土壤中最豐富的門之一,在農田[31]、森林[32]、礦區[30]等均屬于優勢菌群,Rodionov 等[33]對Proteobacteria 的耐受性機理開展研究,結果表明,該類菌群能夠通過EPS、酶促反應等生物作用降低重金屬離子的毒害作用,另一方面能夠充分利用植物、其他菌群的有機質為自身提供營養成分[34].經過多年研究發現, Proteobacteria 門下存在如地桿菌屬 Geobacter[35]、 希瓦氏菌屬Shewanella[36]、脫硫弧菌屬Desulfovibrio[37]、腸桿菌屬Enterobacter[38]等已被證實具有還原固定鈾等環境修復功能的耐受放射性菌種,但是,在本次鈾尾渣中的這些菌種豐度占比較低,這可能是U 等放射性核素在自然條件下無法實現環境自凈的原因之一,后續實現鈾尾渣庫整體的環境修復治理工程需要增加人工干預措施.

3.3 環境因子對微生物群落的影響

與環境土壤樣品相比,OTU 水平上的鈾尾渣中微生物多樣性顯著降低(P＜0.05),這說明鈾尾渣中pH 值較低,且存在比環境土壤含量高出較多的放射性核素U、226Ra、210Po、210Pb 等成分,抑制了非耐受菌群的正常生長.不同深度鈾尾渣中微生物群落多樣性呈現先降低后上升的變化,這可能與不同深度感受放射性核素的強度有關,在5m～15m 之中受到上下層放射性共同影響造成微生物多樣性水平下降,而底層現存污染物濃度較少,削弱了對微生物群落的抑制作用,使得底層微生物多樣性水平提高.

本次分析中,在長期放射性環境下,放射性核素210Po、210Pb 和U 均表現出對鈾尾渣中細菌多樣性的顯著影響,而且除放射性核素外,主要來自于石灰的Ca,當地硫酸型降雨的低pH 值環境和SO42-以及鈾尾渣中的重金屬Mn 均對微生物群落多樣性產生了較強的影響.通過RDA 分析(圖6),鈾尾渣中除Proteobateria、Firmicutes 和Bacteroidetes 外,大多數菌種均表現出了對放射性核素210Po、210Pb、U 和226Ra 的不耐受性,這可能是導致鈾尾渣中微生物多樣性比環境土壤樣品低的另一原因.Zeng 等[24]同樣報道了Proteobateria、Firmicutes 和Bacteroidetes 在不同濃度放射性核素U 脅迫下,均具有的較高耐受強度.但是,本研究中Mn 作為鈾尾渣中成分占比較高的重金屬元素,對這3 類菌群卻產生了明顯的抑制作用,加之鈾尾渣中原本就較低的營養成分SOM,使得該類菌群對環境變化更加敏感[39],從而降低了微生物群落的正常代謝水平,長期暴露在復雜的放射性環境使得鈾尾渣中微生物多樣性(尤其是豐度較低的菌群)受到更多方面挑戰.

通過本研究對鈾尾渣庫多個點位不同深度的微生物群落分析,可以看出,在長期放射性環境下,放射性核素、重金屬元素的遷移和外界降雨的影響等多個因素的綜合作用共同決定了微生物群落的多樣性變化.

4 結論

4.1 鈾尾渣樣品間的理化性質差異顯著,長期堆置下,U、226Ra、210Po、210Pb、Mn、pH 值、SO42-等可遷移性增加,可能會增加環境風險程度,需要對傳統石灰中和處理法進行改良.

4.2 鈾尾渣庫表層與深層的微生物結構差異顯著,在總體上,Proteobateria、Firmicutes 和Bacteroidetes為門水平上的優勢菌群,而Arthrobacter 和Gp16 在屬水平上表現出較強的生長能力.

4.3 不同菌群對環境因子的適應性不同,本研究發現在長期放射性環境下,Proteobateria 和Bacteroidetes 主要表現出對210Po、210Pb、U 的耐受性,而Firmicutes主要表現出對放射性核素226Ra 耐受性.