赤泥改良過程中微生物群落及酶活性恢復研究

董夢陽,董遠鵬,徐子文,邵翼飛,劉喜娟,胡欣欣,劉愛菊* (.山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院,山東 淄博 5509；.山東理工大學資源與環(huán)境工程學院,山東 淄博 5509)

赤泥是氧化鋁工業(yè)提煉過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品,2018 年全球堆積鋁土礦殘渣庫存達到約4.60×109t,年產(chǎn)量約為2.00×108t,成為有色金屬冶煉行業(yè)最主要的固體廢棄物[1-2].我國作為氧化鋁生產(chǎn)大國,有遠超于7000 萬t 的赤泥需要處理,且大量赤泥處置主要以堆存方式為主[3].這種處置方式除占用大量土地外,赤泥因團聚性差、顆粒小、鹽堿性強,易造成揚塵、游離堿及重金屬滲漏等環(huán)境問題[2],進而極易引發(fā)土壤、空氣和地下水污染及安全事故,對周邊生態(tài)環(huán)境及居民生產(chǎn)生活產(chǎn)生嚴重的威脅[4-5].國內(nèi)外研究學者在赤泥減量化、土壤化、資源化等方面做了大量卓有成效的工作,但赤泥的規(guī)模化批量處理與處置仍是一個挑戰(zhàn)[6],對其處置區(qū)域的現(xiàn)場和場外造成潛在的環(huán)境風險越來越受到人們的關(guān)注.近年來,將其轉(zhuǎn)化為生態(tài)工程土壤進行原位恢復和發(fā)展可持續(xù)的植被生態(tài)系統(tǒng)被認為是實現(xiàn)赤泥堆場環(huán)境安全管理的最有效方式[7-8].目前赤泥土壤化的改良主要是摻拌糖蜜酒精廢液[9]、氟石膏、磷石膏[10]、糠醛渣[11]、污泥[12]、泥炭土、蛭石[13]等改良劑的方式進行;同時研究表明這些改良劑可通過酸堿中和作用、沉淀作用或抑制作用顯著降低赤泥堿性,并可增加基質(zhì)中有機質(zhì)含量及有效持水能力;但同時也顯著增加了赤泥的重金屬或表層鹽堿含量[14].其中,有機質(zhì)不僅在促進赤泥基質(zhì)顆粒團聚方面的作用優(yōu)于其他基質(zhì)改良材料,同時顯著提升了微生物群落的代謝能力及其胞外酶活性,且隨著培養(yǎng)時間的增加其質(zhì)地組成逐漸趨于參照土壤[15].

土壤酶參與土壤中絕大多數(shù)營養(yǎng)元素的生物循環(huán)、腐殖質(zhì)的分解與合成以及有機化合物的轉(zhuǎn)化,在赤泥這種不利于土壤微生物增殖的基質(zhì)中,也起非常重要的作用[16].土壤酶活性不僅反映土壤中生物化學過程的強度和方向,也是評價土壤肥力狀況的指標[17],并廣泛用作指示土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康和可持續(xù)性,是反映土壤質(zhì)量變化的生物活性指標[18-19].土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要參數(shù).此外,土壤微生物也是反映土壤微環(huán)境變化的敏感性指標[20],其數(shù)量、組成及多樣性的變化對土壤功能和生態(tài)循環(huán)具有決定性作用,是評價土壤質(zhì)量的重要指標[21].土壤微生物與土壤酶緊密聯(lián)系,在土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)傳遞過程中扮演重要的角色[22],兩者參與有機物質(zhì)分解和合成,以及無機物的氧化與還原的過程,因此是土壤生態(tài)系統(tǒng)代謝的重要動力.然而,對于赤泥的土壤化修復,通常主要選擇化學和礦物學性質(zhì)來評估其進展和土壤形成軌跡,對微生物群落發(fā)育的考慮不夠充分[23].因此,通過對赤泥基質(zhì)酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)組成和豐度及其功能多樣性恢復過程的監(jiān)測,可更為全面地評價其土壤化修復效果.

為此,本研究本著“以廢治廢”的原則,選用粉煤灰、蛭石為主要基質(zhì)改良材料,以園林落葉為有機質(zhì)來源.采用室外培養(yǎng)方法,通過研究分析不同培育時間改良基質(zhì)的pH 值、EC、CEC 等理化指標、氮素(-N)以及關(guān)鍵土壤酶、微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成等生物指標的動態(tài)變化,來評估赤泥土壤化修復效果,以期為赤泥的無害化土壤化修復與治理提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試拜耳法赤泥由山東鋁業(yè)公司提供,其化學成分如表1 所示.現(xiàn)場提取樣品,經(jīng)自然風干后過2mm 樣篩備用.經(jīng)XRD 衍射分析,赤泥的主要礦物組成為赤鐵礦、鋁針鐵礦、石英、三水鋁石、方鈉石、銳鈦礦;粉煤灰的主要礦物組成為莫來石、磁鐵礦、赤鐵礦、石英、方解石等;蛭石的主要礦物組成:輝石、方解石、變體云母、磷灰石、石英、蛇紋石等.

表1 試驗材料化學成分(%)Table 1 Chemical composition of the used materials (%)

1.2 試驗設(shè)計

本試驗共設(shè)置3 個不同處理:純赤泥(RM)、赤泥+粉煤灰(F-RM)、赤泥+蛭石(V-RM),其中,粉煤灰和蛭石的添加量分別為10%和2%.將各處理按10%比例添加有機質(zhì),混合均勻后裝盆、編號,放置于室外自然條件下培養(yǎng),定期澆水,保持使其含水率在70%田間持水量左右,每個處理設(shè)置3 個平行.在培養(yǎng)后第30,180,540d 取樣進行分析測定,將采集的赤泥樣品過2mm 篩后,一部分自然風干用于土壤理化性質(zhì)的測定; 另一部分放入4℃冰箱保存,用于土壤酶活性、微生物群落功能多樣性以及微生物高通量測序的分析與測定.

1.3 主要測試指標及測試方法

1.3.1 改良基質(zhì)的基本理化特性分析 采用環(huán)刀法測定各處理樣品的容重(ρb),采用比重瓶法測定其顆粒密度(ρs)[24],并通過二者計算各樣品的孔隙度.將各處理樣品按1:5 固液比浸提后,采用pH 計( 801型)測定其pH 值,采用6061 型電導率測試儀測定其EC 值[25].陽離子交換量的測定:采用醋酸銨提取、電感耦合等離子體光譜儀(ICP-AES,Optima 5300DV,美國Perkin Elmer公司生產(chǎn))測定浸出液中的陽離子濃度,以各陽離子的總量作樣品的陽離子交換量[24],以Na+占陽離子交換量的百分比作各樣品的鹽堿度.采用紫外分光光度法測定各處理樣品中NO3--N 含量,具體試驗步驟見土壤NO3--N 測試盒(購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)說明書.

1.3.2 土壤酶活性測定 采用土壤酶試劑盒(購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)分析各改良處理培養(yǎng)過程中脫氫酶、脲酶、堿性磷酸酶等關(guān)鍵酶活性的恢復過程.其中,脲酶活性采用苯酚鈉—次氯酸鈉比色法測定,脫氫酶活性采用TTC 分光光度法測定,堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定[16].

1.3.3 Biolog-Ecoplate 分析 采用Biolog Ecoplate (BIOLOGTM, USA)分析各改良處理微生物群落及其代謝功能的恢復過程[26]:稱取相當于5g 干重的新鮮樣品于100mL 三角瓶中,加入45mL 0.05mol/L的滅菌磷酸緩沖液,200r/min振蕩30min混勻.靜置30min,取上清液,按倍數(shù)稀釋法依次用0.05mol/L 的滅菌磷酸緩沖液稀釋1000 倍作樣品的微生物接種液.在無菌環(huán)境條件下,用八通道移液槍移取150μL的接種液移至BiologTMEco-plate 微孔中,之后置于(25±1)℃恒溫條件下避光培養(yǎng)7d,每隔12h 用酶標儀(infinite F200Pro)讀取其在590nm 處吸光值[27].

1.3.4 微生物高通量測序 使用OMEGA 提取試劑盒( E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit)按說明書提供的步驟對赤泥土壤樣品進行細菌和真菌的DNA 提取.之后對細菌16S rDNA 中的V3—V4 高變區(qū)進行 PCR 擴增, 引物序列為 341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3');對真菌的ITS1 區(qū)基因進行 PCR 擴增,引物為 fITS7(5'-GTGARTCATCGAATCTTTG-3')和 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3').將擴增所得的PCR 產(chǎn)物純化回收處理后,利用Qubit? 2.0DNA 試劑盒對所得DNA 準確定量,并將樣品按測序量比例混合后,利用Illumina Hiseq/Miseq PE300 序列平臺(由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司提供)進行測序分析.測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過濾、剔除嵌合體,舍棄低質(zhì)量序列等得到精準分析的優(yōu)質(zhì)序列,優(yōu)質(zhì)序列用于可操作分類單元(OTU)分類與多樣性指數(shù)計算及物種豐度分析.

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 和SPSS version 19.0 處理.赤泥樣品數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析 (ANOVA)和方差齊性檢驗.所有圖表均通過Origin 8.0 繪制.利用Mothur 軟件對每個樣品OTUs做 α-多樣性指數(shù)(Observed species、Chao1、Goods_coverage、Shannon、Simpson)分析.

其中,土壤微生物群落整體代謝活性用孔顏色平均變化率(AWCD)表征,用Shannon 和Simpson 多樣性指數(shù)來描述土壤微生物種群的豐富度和最常見物種的優(yōu)勢度.計算公式如下:

式中:Ci為每孔在590nm 下的吸光值;R 為對照孔吸光值;pi為第i 孔相對吸光值與整板相對吸光值總和之比.

2 結(jié)果與分析

2.1 改良赤泥基質(zhì)的基本理化性質(zhì)

堿性強、鹽分含量高、物理結(jié)構(gòu)差、抗侵蝕能力弱等是赤泥土壤化及資源化利用的關(guān)鍵限制因素[1].而赤泥土壤pH 值、EC 以及鹽堿度是評價赤泥基質(zhì)鹽堿性改良的重要指標,能夠較好地指示土壤鹽害、堿害的風險和鹽堿度的強弱[28].故本研究定期分析測定各處理組的容重、孔隙度等物理結(jié)構(gòu)改良指標的同時,重點監(jiān)測了其pH 值、EC、ESP 等指標在不同培養(yǎng)時間的變化,以分析蛭石和粉煤灰對赤泥基質(zhì)理化性質(zhì)的改良效果(表2).

孔隙度是土壤具有良好保水、透氣性的重要指標,當其達到50%～60%時,即可為生物生長營造出良好的孔隙狀態(tài).由表1 可知,粉煤灰和蛭石的添加并未顯著降低赤泥基質(zhì)容重,但卻顯著增加了其孔隙度,經(jīng)粉煤灰改良后,赤泥基質(zhì)孔隙度增長到58.15%,達到有效范圍.這與Zhu 等[29]研究結(jié)果一致,可能由于赤泥基質(zhì)中含有的大量可交換性Na+降低了有機質(zhì)和礦物組分之間的共價作用,從而導致基質(zhì)中團聚體及黏粒的崩解和分散.而添加粉煤灰后,其含有的大量可交換Ca2+減少了土壤分散性黏粒的數(shù)量,促進團聚體的形成和穩(wěn)定,從而改善了赤泥土壤的環(huán)境,有利于微生物的生存及植物的定植[30].

相比之下,不同處理組的鹽堿性指標(pH 值、EC、ESP)均存在顯著性差異(P＜0.05).培養(yǎng)30d 時,與對照組(RM)相比:V-RM 組pH 值由11.25 降低至10.57,ESP 由79.40%降至75.21%,EC 無明顯變化;F-RM 組pH 值由11.25 降低至10.70,ESP 由79.40%降至66.23%,EC 由1.05mS/cm 降低至0.82mS/cm.隨著培養(yǎng)時間的延長,V-RM 和F-RM 組pH 值、EC、ESP 均降低.培養(yǎng)540d 后,V-RM 和F-RM 組的pH值分別降至9.85 和9.44, ESP 分別降至19.10%和8.02%,EC 降至0.27 和0.35mS/cm,均顯著低于對照處理(RM)的相應(yīng)指標值(表2).這是因為,粉煤灰的礦物相中含有石膏,其含有的Ca2+能與空氣中的CO2以及赤泥中OH－等堿性陰離子發(fā)生沉淀反應(yīng),起到一定的中和作用;同時Ca2+還能與赤泥基質(zhì)中的Na+發(fā)生置換反應(yīng),故通過添加粉煤灰可降低赤泥基質(zhì)的鹽堿性[14].且相比之下,粉煤灰添加對赤泥基質(zhì)的理化環(huán)境的改良效果優(yōu)于蛭石處理.通過一段時間的改良修復,赤泥基質(zhì)的理化性質(zhì)能基本恢復到對照土壤的正常水平,改良效果較為顯著.

表2 各處理樣品的理化指標變化Table 2 Changes of physical and chemical indexes of samples treated

2.2 改良赤泥基質(zhì)的肥力變化

氮是植物生長不可或缺的營養(yǎng)元素,因此赤泥土壤中氮的含量會在很大程度上決定植物的生長情況和發(fā)育狀態(tài).由圖1(a)可知,本研究對不同培養(yǎng)時間的改性赤泥的氮素含量進行測定,發(fā)現(xiàn)通過添加粉煤灰和蛭石改良后赤泥基質(zhì)的硝態(tài)氮含量有所增加,并且隨著培養(yǎng)時間延長,增長更為顯著.培養(yǎng)540d 時,V-RM 和F-RM 組的NO3--N 含量均高于RM 組,分別增加3.41 和28.27mg/kg,F-RM 組改良效果更為顯著.

圖1 不同改良處理對硝態(tài)氮及陽離子交換量的影響Fig.1 Effects of different improved treatments on nitrate nitrogen and cation exchange capacity

陽離子交換作用是土壤最重要的化學性質(zhì)之一,是土壤緩沖性能的主要來源,直接反映了土壤保存、供應(yīng)和緩沖陽離子養(yǎng)分的能力,是土壤中普遍存在的現(xiàn)象,也是改良土壤、合理施肥的重要依據(jù).由圖1(b)可知,不同改良處理組的交換性陽離子變化趨勢基本一致,隨著培養(yǎng)時間的增加而逐漸降低,且V-RM 組中陽離子交換量下降最為顯著;在培養(yǎng)540d 后,各處理組中交換性陽離子含量由高到低依次為:RM 組＞F-RM 組＞V-RM 組.分析其原因,可能是由于粉煤灰或蛭石添加提升了基質(zhì)的孔隙度,進而增加赤泥基質(zhì)中Na+離子的淋洗效果(表2);而且,F-RM 組中陽離子交換量高于V-RM 處理組可能與粉煤灰提供的Ca2+的補給作用相關(guān).這進一步表明粉煤灰對赤泥基質(zhì)的改良效果優(yōu)于蛭石的改良作用.

2.3 改良赤泥基質(zhì)的土壤酶活性的變化

土壤酶活性是近年來土壤質(zhì)量及生態(tài)功能評價中不可缺少的內(nèi)容[21].本研究主要選取了土壤脫氫酶、土壤脲酶和土壤堿性磷酸酶來評價赤泥土壤化修復過程中酶活性的動態(tài)變化,以反映赤泥基質(zhì)中的物質(zhì)循環(huán)及轉(zhuǎn)化動態(tài)[31].其中土壤中脲酶促進酰胺鍵的斷裂,參與氮的循環(huán)[32],磷酸酶參與土壤中磷的循環(huán),促進土壤中有效磷的含量和腐殖質(zhì)的合成.脫氫酶的活性與土壤中生物體的絕大多數(shù)氧化還原反應(yīng)息息相關(guān)[31].

由圖2 可知,RM 組3 種土壤酶活性在自然生長狀況下總體增長較為平緩,而經(jīng)過粉煤灰和蛭石改良處理后,3 種土壤酶活性均顯著增強,即土壤酶活性大小順序為:F-RM 組＞V-RM 組＞RM 組.其中,脫氫酶及脲酶均隨著培養(yǎng)時間的延長酶活性顯著增長,而堿性磷酸酶活性在培養(yǎng)180d 時增長較為緩慢,180d 后快速增長.在培養(yǎng)到 540d時,F-RM 組的土壤脫氫酶、脲酶及堿性磷酸酶活性較RM 組相比分別增長了114.98%、321.26%和560.88%,V-RM 組分別增長了33.53%、215.66%和174.85%.其主要原因為通過添加粉煤灰和蛭石改善了赤泥基質(zhì)的基本理化性質(zhì),從而更適宜微生物生存繁殖以及多種酶活性的增長.但相比之下,粉煤灰添加處理對土壤酶活性恢復的促進作用顯著高于蛭石添加處理.

圖2 不同改良處理中典型土壤酶酶活性的動態(tài)變化Fig.2 Variation of the typical enzymes’ activity in the improved treatments of red mud

2.4 基質(zhì)改良對赤泥微生物群落功能多樣性的影響

平均顏色變化率(AWCD),指Biolog-Eco微平板95 個孔吸光度的平均值,其大小隨時間的變化可作為評價微生物群落整體活性的有效指標之一,與土壤中利用單一碳源的微生物的數(shù)目和種類有關(guān)[33].本研究通過測定AWCD 隨培養(yǎng)時間的變化來反映經(jīng)不同改良處理的赤泥基質(zhì)中的微生物活性及微生物群落功能多樣性[34].

表3 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)Table 3 Functional diversity index of soil microbial community

微生物群落多樣性作為衡量土壤質(zhì)量和評價土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要生物學指標,能夠敏感地反映土壤環(huán)境的微小變化[35].由表3 可知,不同改良處理組的AWCD 值隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷地增加.其中,RM 組AWCD 值在前180d 增長緩慢,而180d 后增長迅速;其余處理組均隨時間顯著增長.在培養(yǎng)540d 時,RM 組的AWCD 值相對較低為(0.504±0.004);V-RM 組為(0.588±0.012),與RM 組相比增加了16.67%;F-RM 組AWCD 值最高為(0.882±0.011),與RM 組相比增加了75%.AWCD 值越大說明其微生物的密度越大,活性越高[36],故不同改良處理的改良效果為F-RM 組＞V-RM 組＞RM 組.

群落多樣性指數(shù)可以用來分析土壤微生物群落的功能多樣性,反映土壤微生物群落利用碳源類型的差異[37].由表3 可知,不同改良處理組隨著培養(yǎng)時間的增加,Shannon 指數(shù)在不斷地增加,即微生物物種豐富度不斷增大.利用粉煤灰和蛭石改性赤泥均促進了赤泥基質(zhì)中微生物Shannon 指數(shù)的增長,且添加粉煤灰改良效果更加明顯.在培養(yǎng)30d 時,V-RM、F-RM 組與RM 組相比Shannon 指數(shù)分別增加了0.01 和0.52;培養(yǎng)540d 時,V-RM、F-RM 組的Shannon 指數(shù)較RM 組增長了0.26 和 2.485.在微生物優(yōu)勢物種方面,在 540d 時不同處理組的Simpson 指數(shù)存在顯著差異性,說明赤泥基質(zhì)改良處理可顯著改變其優(yōu)勢物種的組成.

本研究通過2種不同改良處理赤泥基質(zhì)AWCD值與純赤泥相比顯著增大,說明粉煤灰和蛭石的添加改善了赤泥基質(zhì)的土壤環(huán)境.Jones 等也通過對赤泥進行改良,從而提高其有機質(zhì)和養(yǎng)分含量,使赤泥基質(zhì)的土壤環(huán)境更適宜微生物的生長和繁殖[38].同時根據(jù)土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明,各處理組隨著培養(yǎng)時間的延長,Shannon 指數(shù)在不斷地增加.粉煤灰和蛭石的添加能夠促進赤泥基質(zhì)中微生物群落物種豐富度的快速增長,并且粉煤灰的改良效果更加明顯.

2.5 基質(zhì)改良對赤泥微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響

2.5.1 α-多樣性分析 OTU 是系統(tǒng)發(fā)生學或群體遺傳學研究中,劃定的一個分類單元,通過歸類操作,按照97%的相似性閥值將序列劃分為不同的OTU,每個OTU 被視為一個微生物物種,OTU 的數(shù)量可以代表樣品物種的豐度.Coverage 指數(shù)可用來判斷本次測序結(jié)果能否代表樣本的實際情況.其數(shù)值越高,表明樣本文庫覆蓋率越高.Chao1 指數(shù)可用于反映樣品微生物豐度,而Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)則用于表征微生物群落多樣性.Chao1 指數(shù)值越大,樣品中細菌微生物群落的豐富度就越高;Shannon 指數(shù)值越大,細菌群落的多樣性越高;Simpson 指數(shù)值越小,土壤微生物均勻度越高[39].

表4 不同處理下土壤微生物OTU 及α-多樣性指數(shù)Table 4 The α-diversity index and OTU of soil bacterial and fungal under different treatments

由表4 可知,所有處理Coverage 指數(shù)均在0.99以上,表明本次測序數(shù)據(jù)能夠覆蓋當前狀態(tài)下不同處理樣品中的細菌及真菌種類,符合微生物多樣性分析的要求,能真實反映樣本中的菌群落情況,可用于后續(xù)分析.與添加蛭石、粉煤灰修復處理(T5、T6)30d 相比,對照組(T4)在無任何改良措施的條件下,自然恢復540d 赤泥基質(zhì)中微生物的OTU、Shannon、Chao1 指數(shù)值并未發(fā)生顯著變化;但培養(yǎng)至540d時,OTU、Shannon、Chao1 指數(shù)顯著增加,說明粉煤灰和蛭石的加入可有效促進赤泥基質(zhì)微生物菌群的豐度和多樣性的恢復.其原因可能是由于粉煤灰及蛭石的加入改善了赤泥基質(zhì)的基本理化性質(zhì),為土著微生物提供了良好的生存環(huán)境,致使赤泥基質(zhì)中細菌及真菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化,但與純土壤(T1)相比仍較低,需進一步培養(yǎng)恢復.

2.5.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 由高通量測序分析可知,本研究中細菌主要分屬15 個門(圖3),包括變形菌門(Proteobacteria),酸桿菌門(Acidobacteria),芽單 胞 菌 門 (Gemmatimonadetes), 放 線 菌 門(Actinobacteria),浮霉菌門(Planctomycetes),擬 桿 菌門(Bacteroidetes),綠彎菌門(Chloroflexi)等.通過不同改良處理,細菌群落在門水平上的差異較為顯著.其中變形菌門、放線菌門和芽單孢菌門為純赤泥基質(zhì)(T4)中的優(yōu)勢菌門,其相對豐度分別為21.39%、38.78%和18.42%.在培養(yǎng)540d 后,與純赤泥(T4)相比,兩種改良處理(T5、T6)均顯著抑制了芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)及厚壁菌門(Firmicutes)的生長.其中所包含的芽孢桿菌是一類好氧和兼性厭氧型革蘭氏陽性桿狀細菌或球狀細菌,抗逆性強、生長快、分布極其廣泛,是土壤和植物根際的重要微生物種群[40],因此對赤泥鹽堿環(huán)境具有很好的適用性.而經(jīng)過改良,赤泥基質(zhì)理化性質(zhì)得到一定改善,其所占比例也隨之下降.添加粉煤灰改良(T6)處理后,酸桿菌門(Acidobacteria)菌群豐富度較純赤泥基質(zhì)(T4)有顯著增加,即其在菌群中的占比由0.51%增長到5.43%,但仍顯著低于其在自然土壤中的菌群占比(24.17%).Schmalenberger 等[41]研究發(fā)現(xiàn),通過菌種鑒定和PCR技術(shù)分析,經(jīng)石膏和堆肥處理改良后的赤泥中含有大量酸桿菌,這些菌群通過代謝產(chǎn)酸作用可實現(xiàn)對赤泥堿性的中和調(diào)控,有利于促進赤泥堆場生物修復,在對赤泥強堿性環(huán)境的適應(yīng)及堿性調(diào)控方面有其潛在優(yōu)勢[42].同時,隨著培養(yǎng)時間的延長,赤泥基質(zhì)理化性質(zhì)得到改善,土壤酶活性提高,更加適宜生物生存和繁殖,故細菌的數(shù)量及種類均得到提升.但其微生物群落組成仍與自然土壤存在顯著差異,分析其原因可能與各改良基質(zhì)的鹽堿性環(huán)境相關(guān).

圖3 不同改良處理下細菌門水平的相對豐度Fig.3 The relative abundance of the dominant bacterial phylum under different improved treatments

對不同處理組中的真菌門水平群落結(jié)構(gòu)進行 了高通量測序分析,結(jié)果如圖4 所示.所測不同處理組赤泥基質(zhì)中的真菌主要分屬9 個門,包括子囊菌門(Ascomycota),未分類真菌(Fungi_unclassified),擔子菌門(Basidiomycota),接合菌門(Zygomycota),鞭毛菌門(Mortierellomycota),壺菌門(Chytridiomycota),球 囊 菌 門 (Glomeromycota) 和 羅 茲 菌 門(Rozellomycota)等.當修復方法不同時,赤泥基質(zhì)中的真菌在門水平上的差異較為顯著.純赤泥基質(zhì)中微生物量占比最大的為子囊菌門(Ascomycota,85.71%),其次是未分類真菌(Fungi_unclassified,13.43%)及擔子菌門(Basidiomycota,0.82%).與純赤泥組(T5)相比,改良處理后會降低赤泥基質(zhì)中未分類真菌(Fungi_unclassified)的比例;而粉煤灰的添加(T6)還會增大擔子菌門(Basidiomycota)所占比例、抑制子囊菌門的生長.這與陳凱麗[43]利用有機物修復鹽堿土壤結(jié)果相同.綜上可得,粉煤灰和蛭石的添加可顯著改變赤泥土壤真菌的微生物群落結(jié)構(gòu),與細菌變化相同,赤泥基質(zhì)中真菌的數(shù)量和種類也明顯增加,通過聚類分析可知,添加粉煤灰改良后赤泥基質(zhì)土壤化程度得到一定提升.

圖4 不同改良處理下真菌門水平的相對豐度Fig.4 The relative abundance of the dominant fungal phylum under different improved treatments

2.6 微生物群落結(jié)構(gòu)與主導環(huán)境因子

圖5 環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)影響的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis between soil properties and microbial community structure

將各處理組門水平優(yōu)勢種群與環(huán)境因子相結(jié)合,利用冗余分析(RDA)探究微生物菌群與環(huán)境變化的關(guān)系.如圖5,通過微生物群落與環(huán)境因子間的冗余分析結(jié)果可知,第一、二排序軸分別解釋了89.46%和10.54%的變異,且微生物群落分布特征主要受赤泥土壤pH 值、堿化度ESP、電導率EC、孔隙度及-N 等理化指標影響.V-RM 處理組樣本點分布在第二象限,F-RM 處理組樣品點分布在第四象限,而RM 處理組樣品點處于第三象限,表明不同處理組之間微生物群落組成具有明顯的差異性.此外,分析各環(huán)境因子與優(yōu)勢種群之間的關(guān)系可知,細菌酸桿菌門(Acidobacteria) 、 變形菌門(Proteobacteria)及疣微菌門(Verrucom)與孔隙度和硝態(tài)氮呈正相關(guān)關(guān)系,而藍藻菌門(Cyanobac)、芽單孢菌門(Gemmatimonadetes)及厚壁菌門(Firmicutes)則主要受pH 值、堿化度ESP 及電導率EC 的影響比較大.

3 結(jié)論

3.1 通過添加蛭石和粉煤灰進行改良,有效調(diào)控了赤泥基質(zhì)鹽堿性,其pH 值、堿化度ESP 和EC 值均顯著降低.其中540d 時,F-RM 組pH 值已降至8.49,趨近于參照土壤(8.51);同時,容重、孔隙度也得到明顯改善.

3.2 在肥力水平方面,F-RM 組硝態(tài)氮含量顯著提高,達到了28.27mg/kg,為微生物生存繁殖提供了良好的營養(yǎng)條件.

3.3 與此同時,理化性質(zhì)及肥力水平的改善,進一步刺激了赤泥基質(zhì)酶活性,大幅提高了微生物群落多樣性,表征微生物群落代謝水平的AWCD 值也由0.059 增長至0.882(F-RM 組).

3.4 改良培養(yǎng)后,赤泥基質(zhì)中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,代謝產(chǎn)酸能力較強的微生物,如酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)的所占比例顯著提升,成為優(yōu)勢種群.這些菌群通過代謝產(chǎn)酸作用可實現(xiàn)對赤泥堿性的中和調(diào)控,有利于促進赤泥堆場生物修復.

3.5 綜合比較分析各處理的赤泥土壤化修復改良效果可知,粉煤灰添加處理對赤泥微生物群落結(jié)構(gòu)、代謝活性以及土壤酶功能的促進作用均優(yōu)于蛭石改良處理.這為赤泥土壤化修復在改良材料的選擇方面提供了有效參考.