芘污染鹽堿土壤微生物-電動修復效率影響因素

范瑞娟,馬 艷,張 琇,2,劉雅琴,2 (.北方民族大學生物科學與工程學院,寧夏 銀川 75002；2.寧夏特殊生境微生物資源開發與利用重點實驗室,寧夏 銀川 75002)

隨著石油化工行業的發展,大量有毒有機污染物如多環芳烴(PAHs)通過各種途徑進入土壤,對土壤環境造成嚴重污染[1].工業廢水往往含鹽量很高,因而石油烴類有機污染土壤常伴有鹽堿化的發生[2].開展PAHs 污染鹽堿土壤的修復工作,對農業生產和人類健康發展極其重要.

微生物修復(Bioremediation, BIO)在PAHs 的去除中起著重要作用[3-4].然而,PAHs 水溶性低、生物可利用性差,尤其對于高環PAHs(≥4 個環),高鹽環境更增加了其疏水性,延長了其半衰期[5].采用微生物-電動聯合技術(Bio-electrokinetics, BIO-EK)可通過微生物氧化代謝作用與電動力學效應或電化學氧化作用之間的耦合效應增強PAHs 的去除效率[6].前期研究發現,在BIO-EK 聯合修復石油烴類污染土壤的過程中,隨著修復的進行,污染物去除效率逐漸降低,而微生物群落結構的變化可能是導致污染物降解難度逐漸增加的重要原因[7].然而,BIO-EK 修復過程中微生物群落變化的關鍵影響因素及其與污染物降解效率之間的關系有待于進一步探究.

微生物群落的變化受土壤環境因素影響,而電場的施加可能引起土壤理化性質發生變化.一方面,水的電解作用會導致土壤水分含量減少或分布發生變化,不利于微生物的呼吸、代謝;另一方面,電場的施加引起電極附近pH 值極端化,從而導致微生物數量、豐度減少以及微生物呼吸作用下降[8].隨著電流的持續產生,電極兩端離子的聚集可能使土壤內滲透勢增加,造成微生物細胞失水,使微生物數量下降,代謝能力減弱[9].不同的電場強度所引起的土壤理化性質變化幅度不同,因而所造成的微生物群落變化及其代謝水平變化幅度也不同.如Alshawabkeh等[10]研究發現,較高場強下,土壤離子、水分、pH 值等土壤理化性質變化幅度較大,且較高的電流密度將增加土壤內電勢降,影響微生物細胞膜電位,對微生物細胞內外酶系統及其代謝水平產生抑制作用,當電勢降大于1.5V/cm 時,土壤懸液中部分微生物將出現“休克”現象;劉廣容等[11]研究表明,弱電場(1V/cm)可激活底泥中脫氫酶活性,而強電場(3V/cm)則會降低細菌的活性.不同的電場強度也會引起不同的電流熱效應,因而對微生物生長、活性及其代謝水平產生不同影響.如,Li 等[12]研究發現,適當的電場強度(2V/cm)所產生的電流熱效應有利于微生物的生長代謝,而較高的電場強度(3V/cm)使得土壤溫度過高,將對微生物活性和代謝產生負面影響.另外,也有研究表明,隨著土壤中營養物質的消耗和污染物濃度的變化,微生物群落也將隨之發生變化,進而導致微生物代謝狀態的改變[13].由此可見,土壤環境因素的改變可能導致微生物群落發生變化,從而改變其對污染物的降解能力.因此,深入研究土壤環境因素、污染物濃度與微生物群落之間的相關性,有望揭示BIO-EK 修復中后期制約污染物高效降解的關鍵因素.

本研究以鹽堿土壤中投加芘的方式, 研究微生物-電動修復效率及影響因素.具體是通過監測BIO-EK 修復過程中芘濃度、電流和土壤pH 值、水分含量、溫度等環境因子以及微生物群落變化特征,并分析它們之間的相關性,以期找到影響微生物群落變化的關鍵因素,并明確其與污染物降解效率之間的關系,從而為有機污染物BIO-EK 修復過程調控提供一定的理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗土壤 試驗土壤采自北方民族大學實習基地附近(N 38°29′46″,E 106°6′847″)0～30cm 土層,除去石子顆粒等雜質,自然風干后過篩(＜2mm),121℃滅菌30min 以除去土著微生物.初始土壤部分理化性質見表1.

表1 土壤理化性質初始值Table 1 Initial characteristics of the test soil

1.1.2 污染物 芘(純度＞98%,上海笛柏生物科技有限公司).用二氯甲烷將芘溶解,以300mg/kg 的比例加入土壤中,充分混勻,室溫下避光平衡14d,測得芘的實際初始濃度為288mg/kg.

1.1.3 降解菌 以前期從石油污染土壤中分離出的4 株可降解高環多環芳烴的耐鹽堿菌SYP-1、SYP-2、SYP-5 和SYP-11 為供試細菌,其中SYP-1為代爾夫特菌屬(Delftia sp.),SYP-2 和SYP-11 為海桿菌屬(Marinobacter sp.),SYP-5 為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)[14].用牛肉膏蛋白胨固體培養基活化后,接種于牛肉蛋白胨液體培養基中,30℃、140r/min 培養3d,8000r/min 離心5min,棄去上清液,用無機鹽培養液重懸,再次離心、重懸,獲得OD600nm值約0.25的菌懸液.上述所用培養基的鹽度均為5%,pH 值均為8.6,配制方法參照前期試驗[14].

1.2 試驗裝置及設計

試驗裝置如圖1 所示.該裝置包括PVC 土壤室(20cm×10cm×8cm)、可調直流電源、繼電器、電流表和土壤溫度計各一個,以及不銹鋼電極(20cm×1cm)兩對.土壤室配有聚氯乙烯蓋以防止水分蒸發,繼電器可以設定的時間間隔交替變換電極極性,電 極陰陽間距為16cm,極性相同兩電極間距為8cm.

圖1 試驗裝置 (a)及采樣點 (b)Fig.1 Schematic of the experimental set-up (a) and sampling positions (b)

試驗共設置三組處理:微生物-電動聯合修復(bioelectrokinetics, BIO-EK)、電動修復(electrokinetics,EK)、微生物修復(bioremediation, BIO).此外,設置了對照組(CK).其中, BIO-EK 和BIO 污染土壤中添加嗜鹽堿降解菌的懸浮液,使土壤中的微生物數量達到107～108CFU/g,土壤鹽分和pH值分別為1%和8.0,土壤濕度為最大持水量的67.5%; EK 和CK 中添加相同量的無機鹽培養液,使其鹽度、pH 值和水分含量與BIO-EK 和BIO 中相同. BIO-EK 和EK 在圖1a 所示的裝置中進行,施加的直流電場為1.0V/cm,電極極性每30min 切換一次; BIO 和CK 在與EK 和BIO-EK 相同的土壤室中進行,但不施加電場.將1.5kg 處理好的土壤分層放入土壤室,每一層都被夯實以縮小間隙,試驗共持續91d,定期向土壤中加入去離子水以保持土壤水分.

1.3 試驗方法

1.3.1 電流及土壤理化性質的測定 BIO-EK 中的電流值直接從電流表讀取,每5min 記錄1 次,每天共記錄6 次.土壤理化性質的測定參照《土壤農業化學分析方法》[15]:土壤電導率由電導率儀測定,土壤水分比為1:5 (W/V);土壤溫度用土壤溫度計測量,每天測量一次;土壤pH 值由pH 計測定,土壤水分比為1:2.5 (W/V);土壤含水量用烘干法測定;土壤水溶性鹽總量采用殘渣烘干法測定;陽離子交換量采用乙酸銨法測定;土壤總有機碳含量采用重鉻酸鉀容量法測定;土壤總氮含量采用凱氏法消解,凱氏定氮儀測定;土壤速效氮采用堿解擴散法測定;土壤速效磷含量采用鉬銻抗比色法測定;土壤粒徑分布采用比重計法測定.

1.3.2 土壤中芘含量的測定 BIO-EK、EK、BIO及CK 試驗過程中,每7d 從圖1b 所示的9 個位點取樣,自然晾干后,研磨過篩(40 目),將不同位點土樣充分混勻后提取芘,采用高效液相色譜法(HPLC)測定芘含量,采用外標法進行定量,從而得到芘含量隨時間的變化值.試驗最后一天(91d),除測定混勻后土樣中的芘含量外,還測定9 個不同位點的芘含量,從而得到芘含量隨空間的變化值.芘的提取方法及HPLC操作條件如下:

芘的提取:將風干后的土樣充分研磨過40 目篩,稱取1g 于50mL 的離心管內,加入丙酮和二氯甲烷混合溶劑(1:1)共30mL,蓋好瓶蓋振蕩搖勻后超聲萃取30min(水溫＜35℃),低溫離心2min(8000r/mim),上清液收集至錐形瓶中,再用30mL丙酮和二氯甲烷混合溶劑(1:1)以相同的方法對沉淀物提取兩次,合并提取液.將提取液通風濃縮至干,用色譜純乙腈溶解并定容至1mL,用0.22μm 有機濾膜過濾到棕色液相小瓶中待測.HPLC 操作條件:流動相為乙腈和水,梯度比為:乙腈/水90:10, 0min;乙腈(100%)1min;乙腈/水90:10, 9min;柱溫為25.0℃;流速為1.0mL/mim;進樣體積為10.0μL.

式中:C0為0d時芘的實際測定濃度;Ct為不同處理時間芘的濃度.

1.3.3 微生物群落分析 對0,7,21,63 和91d BIO和BIO-EK 處理組共10 個土壤樣品以及91d BIOEK 處理組不同取樣點的4 個土壤樣品進行微生物群落分析.其中, BIO-EK 組不同取樣點的4 個樣品是將9 個位點(圖1b)樣品合并后所得,具體為:將a1、a2、b1 和b2 合并,表示為a+b; c1 和c2 合并,表示為c1+c2;c3 和c4 合并,表示為c3+c4; c5 單獨表示.

經現場取樣實測，砌體砂漿強度為0.5 MPa，砌筑磚強度滿足MU10磚的強度要求，但砌筑質量差，不平整。

用土壤 DNA 提取試劑盒(QIAGEN GmbH,Germany)提取土壤細菌基因組DNA 后,利用引物338F(5’-ACTCCCTACGGGAGGCA-3’) 和 806R(5’-GGACTACHVTWTCTAAT-3’)擴增V3-V4 區的16S rRNA 基因.擴增程序為98℃變性2min;98℃變性30s,50℃變性30s;72℃變性60s,循環30次;72℃延伸5min.PCR 產物用DNA 純化試劑盒(Omega,America)純化,然后采用NanoDrop 2000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA)定量.使用Illumina 的NEBNext Ultra DNA 文庫制備試劑盒(NEB, USA)建立測序文庫,將質檢合格的文庫通過Illumina HiSeq2500 平臺(Biomarker Technologies Co., Ltd., Beijing, China)進行高通量測序.將得到的原始圖像數據文件經堿基識別(Base Calling)分析轉化為原始測序序列(Sequenced Reads),進行數據預處理:首先,采用FLASH v1.2.7 通過overlap 對每個樣品的reads 進行拼接,得到原始Tags 數據(Raw Tags);其次,采用Trimmomatic v0.33 對拼接得到的Raw Tags 進行過濾,得到高質量的Tags 數據(Clean Tags);最后通過UCHIME v4.2 鑒定并去除嵌合體序列,得到最終有效數據(Effective Tags).通過USEARCH v11.0.667 在97%的相似度水平上對Tags 進行聚類,獲得分類操作單位(OTUs),并基于silva 分類學數據庫對OTU 進行分類學注釋,用Venn圖表示樣品之間共有或特有的OTUs.將OTU 的代表序列與微生物參考數據庫進行比對得到每個OTU 對應的物種分類信息,進而在各水平(phylum、class、order、family、genus、species)統計各樣品群落組成,利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表,利用R 語言工具繪制樣品各分類學水平下的群落結構圖.利用Mothur(v. 1.30)對樣品的ACE和Chao1(物種豐度)、Shannon 和Simpson (物種多樣性)等α 多樣性指數進行評價.利用qime (v1.8.0)對β 多樣性指數進行分析,包括主成分分析(PCA)、主坐標分析(PCoA)和非度量多維尺度分析(NMDS).利用典型對應分析(Canonical correspondence analysis, CCA)分析微生物群落結構對土壤理化因子的響應.

1.4 數據分析

每個分類層次上的群落結構圖、熱圖、多樣性指數分析圖均采用R 語言工具(v. 3.0.2)繪制,其他圖形采用Excel 2019 繪制;方差分析采用SPSS 17.0(SPSS Software, USA)中“Duncan”法;Beta 多樣性基于Bray Curtis 算法進行分析.

2 結果與討論

2.1 土壤中芘的降解

由圖2 可知, 91d 后BIO-EK、BIO、EK 和CK中芘的濃度由初始的288.03mg/kg 分別降至73.40,114.23,150.27,256.09mg/kg(圖2(a)).采用一級動力學模型擬合不同處理過程中石油的降解,回歸方程的相關系數為0.9678～0.9827,模擬效果較好.在91d 的處理過程中,BIO-EK 中芘的降解速率常數最大,為0.0151d-1,半衰期為45.90d,而BIO 和EK 中芘的降解速率常數分別為0.0111 和0.0078d-1,半衰期分別為62.45 和88.87d,而CK 中芘的降解速率常數僅為0.0012d-1,半衰期長達577.62d(表2).以上結果表明BIO-EK 聯合修復有利于促進芘的降解.相較而言,BIO、EK 和BIO-EK 處理過程中,前期芘的降解速率較大,后隨著處理時間的延長,降解速率逐漸降低(圖2a),與前期研究結果相似[7].CK 和BIO 中,芘在各取樣點(a1、a2、b1、b2、c1、c2、c3、c4 和c5)的降解率無明顯差異(P＞0.05),而EK 和BIO-EK 組中離電極較近的取樣點(a1、a2、b1 和b2)降解率高于其他位點(P＜0.05).EK 和BIO-EK 組中a1、a2、b1 和 b2 點的降解率范圍分別為49.3%～49.6%和79.1%～80.5%;c1、c2、c3 和c4 點的降解率范圍分別為45.3%～48.5%和69.9%～76.9%;離電極最遠的c5 點降解率最低,分別為43.5%和65.2%(圖2(b)).電場強度在空間上的差異會引起污染物降解速率的不同,具體來說其與污染物降解速率呈正相關, 該現象已在前期的研究中所證實[7,13,16-17].除此之外,土壤微環境變化以及由此引起的微生物群落結構變化可能是導致芘降解效率發生時間和空間上變化的重要原因.

圖2 不同處理土壤中芘濃度隨時間變化及91d 不同取樣點芘的降解率Fig.2 The variation of pyrene concentration with time in different treatments and the degradation rate of pyrene at different sampling sites by day 91

表2 不同處理芘降解的一級動力學方程Table 2 First-order kinetic equations of pyrene degradation in different treatments

2.2 BIO-EK 處理過程中電流變化

圖3 為BIO-EK 試驗過程中電流變化情況.施加電場1d 后電流略有上升(由240mA 上升至247mA),隨后則迅速降低,在整個試驗過程中,雖然由于水分的補充使電流有所回升,但整體上呈下降趨勢,至91d 時,下降至23mA.本研究土壤鹽度較高(1%),因而BIO-EK 中的電流峰值高于其它研究[18-19].在一個穩定的電壓梯度下,電流的變化反映了電導率的變化,而電導率的變化與土壤的含水量、離子濃度等參數密切相關[20].試驗初期電流有所上升,可能由于電場的施加促進了土壤中無機離子的解吸,增加了可溶態離子含量.隨后電流強度快速降低,一方面可能源于電解作用引起的土壤含水率的降低(圖4);另一方面,可能由于電解作用所產生的OH-同土壤中的一些陽離子,如Ca2+、Mg2+和Al3+等形成氫氧化物沉淀,使土壤溶液中可溶性離子減少[21].此外,電化學腐蝕引起的電極損耗可能也是引起電流降低的原因之一.在電動力學修復過程中,電流是影響電化學氧化效率的重要因素,通常情況下,電流越大,污染物去除效率越高[22].而在微生物-電動聯合修復過程中,電流本身可能引起微生物生長繁殖、活性和群落結構發生變化[23],或者通過影響土壤微環境從而對微生物群落產生影響,進而影響到污染物降解效率[24].

圖3 BIO-EK 試驗過程中電流變化Fig.3 Changes in electric current during the experimental period of BIO-EK

2.3 土壤水分含量變化

在微生物-電動聯合修復中,適當的土壤濕度是電化學反應正常進行以及微生物保持較高代謝能力的重要保證[25].圖4 為不同處理土壤濕度隨時間和不同采樣點變化情況.試驗過程中,CK 和BIO 中的土壤平均濕度變化幅度較小,分別為最大持水量的63.1%～69.0%和60.3%～72.2%,而EK 和BIO-EK中土壤濕度在施加電場后即由于電解作用而明顯下降,14d 后由最大持水量的68.9%和69.0%分別下降至40.7%和40.8%(圖4a),雖然定期向土壤中補充水分,并周期性切換電場極性,但水分消耗明顯大于以往研究結果[26-27],可能由于本研究土壤鹽度較高(1%),電流強度較大,因而所引起的電化學反應較強所致.土壤中水分含量的減少會導致土壤電阻增大,電流減小,從而對微生物群落產生負面影響[12,28].91d 后,CK 和BIO 處理土壤中,不同取樣點土壤濕度無明顯變化(P＞0.05),而EK 和BIO-EK 處理土壤中,各點之間土壤濕度分布呈現不均勻的狀態,整體來看,電極附近(a1、a2、b1 和b2)土壤濕度高于其它位點(P＜0.05)(圖4b),可能由于電滲析作用引起[29],但由于周期性切換電極極性,使得土壤濕度在空間上并未發生極端變化.

圖4 不同處理土壤濕度隨時間變化(a)及91d 不同取樣點土壤濕度(b)Fig.4 Changes in soil moisture content with time in different treatments (a) and the soil moisture content at different sampling sites by day 91 (b)

2.4 土壤溫度變化

圖5 為不同處理中土壤溫度隨時間的變化.監測結果表明,土壤溫度隨處理時間呈現上下波動的趨勢,但波動幅度有所不同,施加電場的試驗組(EK和BIO-EK)與未施加電場的試驗組(CK 和BIO)溫度波動范圍分別為26～32℃和27～37℃.施加電場的EK 和BIO-EK 組的平均溫度比CK 和BIO 組的平均溫度高1～7℃.而前期研究發現施加電場與未施加電場的試驗組之間土壤溫度無明顯差異[7].Acar等[30]研究發現,不對電壓梯度進行任何控制時,焦耳熱可使土壤溫度升高10～20℃.又有研究表明電流密度較小時往往觀察不到熱效應[31].在本研究中,由于較高的電流密度值,使得土壤產生了明顯的溫度變化.土壤溫度適當升高,一方面可通過影響有機污染物的物理狀態、化學組成等加快污染物的生物轉化速率[32],另一方面可能通過影響微生物群落結構而影響污染物的降解效率[24].

圖5 不同處理土壤溫度變化Fig.5 Changes in soil temperature in different treatments

2.5 土壤pH 值變化

圖6 不同處理土壤pH 值隨時間變化(a)及91d 不同取樣點土壤pH 值(b)Fig.6 Changes in soil pH with time in different treatments (a)and the soil pH at different sampling sites by day 91 (b)

由圖6 可知,試驗過程中,各處理土壤平均pH 值在較小范圍內波動(8.42～8.67).CK 和BIO 試驗中,各采樣點之間pH值沒有明顯差異(P＞0.05),而EK和BIO-EK 組不同點pH 值之間變化幅度較大,尤其表現在電極附近.具體來看,EK 和BIO-EK 中,電極附近的a1、a2、b1 和b2 點,pH 值變化范圍分別為7.59～9.70 和7.60～9.67,而c1～c5 點之間的pH 值變化范圍較小,分別為8.22～8.55 和8.48～8.60(圖6b).當向土壤中施加電場時,電極上發生的電解水反應會使電極附近土壤pH 值發生大幅度變化[33],而該變化一方面可以通過影響土壤中離子的吸附與解吸、沉淀與溶解而影響電滲流的方向和速度,進而對土壤中污染物的存在形態、電化學氧化反應速率等產生重大影響[21],另一方面,可能通過影響微生物的活性、數量、多樣性及群落結構等進而對污染物降解效率產生影響[34].本研究通過每30min 切換一次電極極性的方式消除了電極附近土壤極端pH 值的產生,但相較于前期研究結果[7],EK 和BIO-EK 電極附近土壤pH值仍有較大幅度的變化,可能與較強電流引起的較強的電化學反應有關,而該變化可能影響微生物群落結構,進而對污染物降解效果產生影響.

2.6 微生物群落變化

14 個樣品測序共獲得1,119,259 對Reads,雙端Reads 拼接、過濾后共產生1,018,506 條Clean tags,每個樣品至少產生49,213 條Clean tags,平均產生72,750 條Clean tags.在97%的相似度水平上對tags進行聚類,獲得每個樣品的 OTU 數,所有土樣16SrRNA 測序文庫覆蓋率均大于99%,說明測序深度合理(表3).

表3 土壤樣品微生物豐度與多樣性Table 3 Richness and microbial diversity indices in soil samples

2.6.2 微生物群落結構分析 根據主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)(圖7b),BIO 中0～21d 樣品較為集中,63～91d 較為集中,說明0～21d微生物群落結構較接近,而63～91d 較接近,同時說明微生物群落變化主要發生在63d 后;施加了電場的BIO-EK 組各取樣時間樣品分布較分散, 說明電場的施加使微生物群落結構發生了明顯的變化.同時,BIO-EK中不同采樣點樣品聚集在一起,說明不同取樣點之間微生物群落結構變化較小.聚類分析(圖7c)結果進一步表明,BIO 中微生物群落變化主要發生在63d 后,而BIO-EK 組中微生物群落結構在7d 后即發生了明顯的變化,但在空間上的變化相對較小.

圖7(d)顯示了不同時間和不同位點土樣中微生物種類在門水平上的組成和相對豐度.對各樣品前10 種優勢菌門的相對豐度進行分析,結果表明,厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度較高, 而這些菌門在烴類污染土壤的修復方面起重要作用[38-41].BIO 處理土壤中Firmicutes 在前63d 所占比例最高(42.7%～52.2%), 91d 時降低至19.0%,Proteobacteria 在前21d 的豐度(39.1%～48.7%)僅次于Firmicutes,后期則明顯降低,至91d 時降至12.9%;Actinobacteria 和Bacteroidetes 的豐度整體上隨處理時間呈現逐漸上升的趨勢,至91d 時,分別由初始的0.5%和 0.2%增加至 34.1%和 23.4%.相較而言,BIO-EK處理土壤中微生物群落結構7d后即發生了明顯變化.其中, Firmicutes 和Proteobacteria 均呈現先下降后上升的趨勢,具體為,前21d 由初始的58.8%和31.4%分別降至11.5%和11.2%,至91d 時又分別上升至45.3%和22.1%; Actinobacteria 豐度隨處理時間呈逐漸增加的趨勢,91d 后其比例由初始的6.5%增至28.6%;且與BIO 不同的是,在7～63d 的土樣中檢測到了較高豐度的藍藻門(Cyanobacteria),其豐度隨時間呈現先上升后下降的趨勢, 21d 比例達62.3%.研究表明,Cyanobacteria 可生活在極端環境中,能降解包括石油烴、PAHs 等在內的多種有機污染物[42].

綱水平(圖7e)變化特征進一步說明BIO 處理土壤中微生物群落機構在63d 后發生了明顯的變化,而施加了電場的BIO-EK 組,其土壤微生物群落結構變化尤為明顯,7d 后即發生了明顯變化.對各樣品前10 種優勢菌綱的相對豐度分析表明,BIO 中桿菌綱(Bacilli)和γ-變形菌綱(gammaproteobacteria)在前21d 豐度最大,分別為37.6%～50.3%和38.9%～48.6%,后期則快速降至8.6%～13.3%和2.4%～5.0%;放線菌綱(Actinobacteria)和擬桿菌綱(bacteroidia)豐度隨處理時間大體上呈逐漸增加的趨勢,至91d 時,其比例由初始的 0.5%和 0.2%分別上升至 34.0%和23.2%.BIO-EK 中Bacilli 和gammaproteobacteria 豐度在7d后即明顯降低,21d后分別由初始的58.8%和31.4%降至11.5%和11.2%,后期又逐漸上升,91d 后分別增至45.2%和19.9%;7～63d 的土樣中檢測到了較高豐度的產氧光細菌綱(Oxyphotobacteria),其在21d 的豐度達62.3%.

不同取樣點之間微生物群落組成相似,但各組成豐度有一定的變化.從門水平看,離電極最遠的c5點,其 Actinobacteria (14.9%)豐度低于其他位點(20.8%～41.9%),而Firmicutes(41.7%)、Proteobacteria(29.0%)和Bacteroidetes (10.9%)豐度均稍高于其他位點(三個菌門豐度分別為30.4%～41.4%、19.7%～28.0%和 1.3%～6.4%).從綱水平看,不同取樣點Bacilli 豐度變化范圍為30.3%～38.5%;電極附近(a+b)土樣中gammaproteobacteria (16.8%)豐度稍低于其它位點(22.7%～23.8%),而a+b和c1+c2點Actinobacteria(34.1%～39.8%)豐度稍高于其它位點(13.8%～18.1%).這種空間上的差異可能與土壤含水率(圖4b)和pH值(圖6b)所發生的空間上的變化有關[35].

不同處理時間及不同采樣點土樣中優勢菌屬的變化如圖7f 所示.BIO 修復過程中,前21d 海桿菌屬(Marinobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)為優勢菌屬,其中Marinobacter 和 Bacillus 為試驗初期所添加的外源菌株,說明其在芘污染鹽堿土壤中具有較強的競爭力和適應性,而同時接種的代爾夫特菌屬(Delftia)并未被檢測到,說明其競爭力及適應性較弱. Marinobacter 是一種耐鹽堿菌屬,其可利用多種不同碳氫化合物作為碳和能量的唯一來源[43-44]; Bacillus 是一種常見烴類化合物降解菌屬[45];研究證明Staphylococcus[46]、Virgibacillus[47]均具有PAHs 降解能力.BIO 修復后期優勢菌屬發生了明顯的變化,且豐度明顯降低,其中,63d 所檢測出的 優 勢 菌 屬 為 uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae 和乳桿菌屬(Lactobacillus),而91d 后紅球菌屬(Rhodococcus)成為優勢菌屬,其被證明可產生胞外表面活性劑,能降解多種烴類化合物[48].BIO-EK 處理過程中,初始優勢菌屬為Bacillus、Marinobacter 和Staphylococcus,7d 后則發生了明顯的變化,其中7～63d 主要的優勢菌屬為Lactobacillus、Rhodococcus和uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae,91d 后Bacillus 和Marinobacter 豐度明顯回升,除此之外,優勢菌屬還有Staphylococcus、鹽單胞菌屬(Halomonas)和氣微菌屬(Aeromicrobium).其中,Halomonas 多具有耐鹽堿性[49],并具有PAHs 降解能力[50], Aeromicrobium 中的某些菌種也具有耐鹽堿性[51],并具有PAHs 降解能力[52].不同取樣點優勢菌屬為 Staphylococcus、Aeromicrobium、Marinobacter、 鹽Halomonas 和Bacillus.

圖7 土壤微生物群落變化Fig.7 Changes in soil microbial community

2.7 土壤環境因子與微生物群落結構的關系

土壤中污染物濃度的降低以及營養物質的消耗使得土壤營養比例發生變化,可能導致微生物群落結構改變,除此之外,BIO-EK 修復過程中,電場的施加引起土壤性質如pH 值、含水量、溫度等發生變化,也可能導致土壤微生物群落的改變,進而影響到污染物的降解效率[27,35].為分析BIO 和BIO-EK處理過程中土壤環境因子與微生物群落結構的關系,以土壤中芘濃度、pH 值、土壤濕度(土壤含水量占最大持水量的比例)和溫度為土壤環境變量,以微生物群落在屬水平上的相對豐度為物種數據,作典型對應分析(CCA)(圖8).根據圖8a,前兩個排序軸分別解釋了BIO 處理土壤中微生物群落變化的48.5%和40.5%,前兩軸總共解釋了89.0%,軸1大部分被芘濃度、溫度所解釋,與Staphylococcus、Bacillus 呈正相關;軸2 主要被pH 值所解釋,與Rhodococcus 呈正相關.根據圖8b,前兩個排序軸分別解釋了BIO-EK 處理土壤中微生物群落變化的45.4%和24.1%,前兩軸總共解釋了69.5%,對微生物群落結構影響最大的因素為土壤pH 值,其次為芘濃度和土壤溫度, 其與 Marinobacter 、Staphylococcus、Bacillus、Aeromicrobium 呈正相關,盡管BIO-EK 中土壤濕度有較大幅度的波動,但其對土壤微生物群落結構未產生重大影響.結果表明,土壤pH 值、芘濃度以及溫度的變化是引起BIO 和BIO-EK 處理土壤中微生物群落結構發生變化的主要原因,而微生物群落結構的變化又可能是造成芘不能持續高效降解的重要原因.

圖8 BIO 和BIO-EK 處理過程中微生物群落結構與土壤環境因子的典型對應分析Fig.8 Canonical correspondence analysis (CCA) of microbial community composition and soil environmental factors in the treatments of BIO and BIO-EK

3 結論

3.1 BIO-EK 聯合修復有利于促進土壤中芘的降解.在91d的處理過程中,BIO-EK中芘的降解速率常數為0.0151d-1,半衰期為45.90d,而單獨的BIO 和EK修復中芘的降解速率常數分別為0.0111和0.0078d-1,半衰期分別為62.45 和88.87d;采用一級動力學模型擬合不同處理過程中石油的降解,回歸方程的相關系數為0.9678～0.9827,模擬效果較好.

3.2 BIO-EK 處理過程中芘的降解不能持續高效地進行.CCA 分析表明,電場的施加所引起的土壤pH 值和溫度的變化,修復過程中芘濃度的變化,以及由此引起的微生物群落結構的變化可能是導致芘不能持續高效降解的重要原因.

3.3 通過調節土壤微環境、構建高效降解菌劑等方式對BIO-EK 修復過程進行調控,有望達到持續高效降解污染物的目的.