祥云縣蝙蝠糞便中攜帶的病毒調查研究

潘 虹 馮 云 董興齊

（1.大理大學 云南大理 671000；2.云南省地方病防治所病毒立克次體病防治科 云南大理 671000；3.云南省傳染病專科醫院 云南昆明 650000）

蝙蝠是一類古老的翼手目哺乳動物，是病毒“存儲庫”。蝙蝠的數量占哺乳動物的1/5。地球上的蝙蝠有1 100多種，進化了將近5千萬年[1]。蝙蝠分為大蝙蝠亞目和小蝙蝠亞目。大蝙蝠通常食用花蜜、花粉、水果等。小蝙蝠亞目的蝙蝠多食用動物血，捕食昆蟲、魚類，有時候也食用少量水果。蝙蝠是一類群居動物，種群數量往往成千上萬，多數在夜間活動，四處飛行覓食。在氣溫較冷的冬季，它們會選擇冬眠（降低身體代謝率，從而減少能耗）或遷徙[2]。蝙蝠的特殊免疫機制及生活環境使其具有強大的帶毒能力。隨著人類活動范圍擴大，蝙蝠與人類接觸越來越密切、頻繁，成為蝙蝠傳播病毒到家畜與人類的一大誘因[1]。

既往研究報道過，國內外多個團隊在蝙蝠的糞便中進行宏基因學檢測[3]，查到相關的病毒核酸片段，包括RNA病毒與DNA病毒：腺病毒屬[3-4]、皰疹病毒屬[3-4]、異樣皰疹病毒屬[4]、乳頭瘤狀病毒屬[5]、正嗜肝病毒屬[5]、A型輪狀病毒屬[5]、α冠狀病毒屬[3]、β冠狀病毒屬[3]、腸道病毒屬、丙肝病毒屬等。

一、材料與方法

（一）標本采集

本實驗組于2017年7月、8月在祥云縣清華洞內（經緯度100°E，25°N，環境21℃～23℃，海拔1 980～1 998 m）采集蝙蝠糞便標本480份。經現場形態學初步分類鑒定，蝙蝠種類有水鼠耳蝠（Water bat）和棕果蝠（Rousettus leschenaultii）兩種。糞便標本的采集分為2種方式：1.對捕獲的蝙蝠用肛拭子采集后放飛；2.若采集肛拭子時蝙蝠死亡，則解剖蝙蝠，取距肛門處2厘米直腸。所有樣本現場保存于液氮中，帶回實驗室。

（二）主要試劑及儀器設備

主要試劑：DNA提取試劑盒(天根)、RNA提取試劑盒(QiAgen)、逆轉錄試劑盒Ready-to-go、PCR mix(Promega/Takara)、PBS緩沖液(速研)、標準瓊脂糖(Invetrigen公司)、DL2000 DNA Marker(Takara公司)。主要儀器設備：-80℃冰箱(海爾)、生物安全柜(Niuer)、移液器、水浴鍋、冷凍離心機、PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像儀。

二、實驗步驟及方法

（一）提取總RNA、逆轉錄制備cDNA文庫

共480份，同種、同屬5份蝙蝠樣品合并為一份，合并后共96份樣本。將QiAgen試劑盒（50kit）中的所有液體在使用前按照說明書配好，按照說明書提取總RNA。用Ready-to-go試劑盒，按照說明書操作，逆轉錄制備cDNA文庫。

（二）DNA的提取

用天根試劑盒提取DNA，在使用試劑盒前將盒子準備好，按照說明書提取樣本DNA。

（三）引物

引物由上海生工合成，使用濃度為10 pmol/μl。

表1 引物信息

（四）序列測定和分析

對PCR擴增陽性的產物進行序列測定，所有測序在生工生物工程（上海）股份有限公司昆明辦事處完成。使用DNAstar軟件包中的SeqMan對序列片段進行拼接、編輯、校正；應用MEGA 5.0軟件鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹。

三、結果

（一）蝙蝠攜帶的DNA病毒情況

本次實驗檢測祥云縣清華洞內蝙蝠糞便中攜帶的1種DNA病毒（腺病毒擴增1種基因片段）和5種RNA病毒（輪狀病毒擴增3個基因片段，其余4種病毒包括腸道病毒、黃病毒、乙腦病毒、甲病毒每種病毒擴增1種基因片段），共擴增8個基因。5種RNA病毒檢測結果陰性。DNA病毒腺病毒陽性84份樣本。

腺病毒電泳結果圖1所示，所有標本電泳結果有84份陽性，目標片段261bp，隨機抽取5份送去測序。

圖1 腺病毒電泳結果（目標片段261bp）

（二）病毒基因片段的測序及分析

在NCBI數據庫中進行Blast比對后，腺病毒與2010年發現的蝙蝠源哺乳動物腺病毒Bat adenovirus isolate 1285-YNMr（No.GU226966）核苷酸序列相似度為96%，該病毒屬于雙鏈DNA病毒腺病毒科未分類哺乳動物腺病毒屬。

KY009650是來自中國南方發現的蝙蝠腺病毒。本次實驗的蝙蝠糞便中的腺病毒與2007年云南蝙蝠糞便中的腺病毒有較高的親緣關系。

四、討論

本次實驗中其他病毒未檢測到，并不能說明蝙蝠糞便中無該病毒的存在。就RNA病毒來說，由于蝙蝠糞便中污染嚴重，提核酸、逆轉錄、PCR擴增容易實驗失敗，往往檢測不出。因此，研究者考慮嘗試使用宏基因學的方法，可以充分利用樣本，探查蝙蝠糞便內的其他病毒。

本次實驗的蝙蝠糞便中的腺病毒與2007年云南蝙蝠糞便中的腺病毒有較高的親緣關系，說明腺病毒在云南蝙蝠體內檢出率高。腺病毒作為1950年就發現的病毒，人類對其研究比較多。腺病毒可感染多種脊椎動物，魚類、爬行動物、兩棲動物、鳥類、哺乳動物，以往在蝙蝠體內也曾檢測出，說明攜帶腺病毒的物種比較廣、數量多。

1953年，科研工作者首次從嬰兒的呼吸道感染扁桃體中分離得到腺病毒。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，無包膜由252個殼粒呈二十面體排列包裹而成，一顆內包裹的雙鏈DNA兩端各有大約100bp的反向重復序列。腺病毒分為A、B、C、D、E、F、G 7個亞群（subgroup），基因型已經鑒定出超過100種。人腺病毒 (Humanadenovirus，HAdV) 屬于腺病毒科 (Adenoviridae)哺乳動物腺病毒屬Mastadenovirus。腺病毒能感染、眼、胃腸道、呼吸道、尿道和膀胱，較常發生在眼角膜和呼吸道。

本次研究中檢測出的腺病毒基因片段在進化樹蝙蝠腺病毒分支上與云南蝙蝠、中國北方的蝙蝠腺病毒處于同一分支，說明還是具有一定的相似性。但是，本次的5個病毒株在次級分支是獨立成一支，說明與之前發現的蝙蝠腺病毒還是稍有不同，尤其是XYBF201710、XYBF201730、XYBF201740、XYBF201755在同一簇，而XYBF201784獨立成一簇，表明XYBF201784與其他幾株還是有不同，可能存在變異。2007～2008年，葛興義等在一批云南省的蝙蝠糞便內檢測出蝙蝠腺病毒，并且分離出蝙蝠腺病毒毒株TJM。該病毒能引起哺乳動物細胞發生細胞病變。這提示蝙蝠體內的腺病毒與哺乳動物甚至人類疾病有一定關系。蝙蝠生活在潮濕的洞穴中，肛拭子檢測出的腺病毒至少提示了祥云縣的蝙蝠攜帶腺病毒，但實際感染率應該高于試驗檢測的陽性率，因為肛拭子還存在保存不當、核酸提取不出或樣本的病毒量太少等問題。腺病毒主要通過呼吸道傳播。蝙蝠長期群居為腺病毒在種群間傳播創造了便利條件。此次調查腺病毒在祥云清華洞蝙蝠中的流行情況有助于評估病毒傳染人類的潛在危險性，對疾病的防控具有指導意義。

圖2 祥云縣清華洞蝙蝠直腸攜帶的腺病毒Dpol基因進化樹