微滴式數(shù)字PCR與IHC聯(lián)合FISH對(duì)乳腺癌新輔助化療前后HER-2檢測(cè)的分析

彭 燕，鄭細(xì)閏，劉紅英，何青蓮，鄭廣娟

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一[1]。術(shù)前新輔助化療在局部晚期乳腺癌患者的治療中發(fā)揮了重要作用，并取得了較好的臨床療效[2]。HER-2是位于17號(hào)染色體上的跨膜蛋白，具有跨膜酪氨酸激酶活性，10%～25%的乳腺癌組織中可以檢測(cè)到HER-2蛋白過表達(dá)[3-4]，因此HER-2基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。目前，臨床常用的檢測(cè)方法主要為免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)及熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)，雖廣泛運(yùn)用但仍存在一定判讀問題[5]。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)是一種檢測(cè)核酸分子的絕對(duì)定量技術(shù)，其運(yùn)用直接的計(jì)數(shù)目標(biāo)基因和參照基因(已知拷貝數(shù))數(shù)目，通過計(jì)算其比值，就可得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)[5]。本實(shí)驗(yàn)利用ddPCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌新輔助化療前后的HER-2擴(kuò)增情況，并與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)這一傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行結(jié)果對(duì)比，驗(yàn)證ddPCR檢測(cè)的可行性，為臨床選擇該檢測(cè)方法提供可靠性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料本實(shí)驗(yàn)通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院病歷系統(tǒng)及朗伽病理系統(tǒng)收集了確診為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者62例(術(shù)前均未接受放、化療及內(nèi)分泌治療、靶向藥物等新輔助治療的穿刺活檢組織和經(jīng)過規(guī)范新輔助化療后的手術(shù)根治標(biāo)本)納入實(shí)驗(yàn)，編號(hào)為1、2、3……62，患者均為女性，年齡28～82歲，平均(52±12.85)歲。

1.2 儀器與試劑常規(guī)儀器有全自動(dòng)免疫組化儀、StatSpin雜交儀，Droplet Digital PCR系統(tǒng)、T100熱循環(huán)儀、PX1 PCR plate Seale及微滴控制分析軟件。試劑主要有Ultra View DAB檢測(cè)試劑盒和HER-2抗體均由羅氏診斷公司提供，F(xiàn)ISH檢測(cè)試劑盒由北京金菩嘉醫(yī)療公司提供，ddPCR試劑盒由伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)公司提供。

1.3 方法乳腺癌標(biāo)本離體后立即經(jīng)10%中性福爾馬林固定6～24 h，按照病理科流程常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片4～10張。

1.3.1IHC 采用Bench Mark XT全自動(dòng)免疫組化儀對(duì)HER-2進(jìn)行檢測(cè)，HER-2積分為2+的不確定病例則按試劑盒說明書操作進(jìn)行FISH檢測(cè)。

1.3.2ddPCR檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說明操作將樣本提取和純化DNA，將含有樣品的20 μL DNA反應(yīng)液置于微滴發(fā)生器的樣品孔中并加入70 μL微滴生成油使其生成納升級(jí)的油包水液滴，之后取40 μL轉(zhuǎn)入96孔板中用鋁箔熱封膜密封，置于Bio-Rad C1000熱封膜儀上，進(jìn)行40個(gè)常規(guī)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，最后利用檢測(cè)儀自帶控制分析軟件進(jìn)行熒光檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

1.4 HER-2結(jié)果判讀

1.4.1IHC染色結(jié)果評(píng)估 參照我國(guó)《乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2019版)》[6]：腫瘤細(xì)胞無著色為0；>10%癌細(xì)胞呈不完整的微弱細(xì)胞膜染色為1+；>10%癌細(xì)胞呈完整弱至中等強(qiáng)度的細(xì)胞膜染色或≤10%浸潤(rùn)癌細(xì)胞呈強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色為2+；>10%癌細(xì)胞呈強(qiáng)且完整、均勻的細(xì)胞膜著色為3+。結(jié)果判讀：0～1+為陰性，2+為可疑陽(yáng)性，3+為陽(yáng)性。

1.4.2FISH結(jié)果判讀 參照我國(guó)《乳腺癌HER-2檢測(cè)指南(2019版)》[6]：(1)平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0判為FISH陰性。(2)HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥6.0判為FISH陽(yáng)性。(3)HER-2/CEP17比值<2.0，4.0≤平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞<6.0，此種情況建議重新計(jì)數(shù)至少20個(gè)細(xì)胞核信號(hào)，如果結(jié)果改變，則對(duì)2次結(jié)果進(jìn)行綜合判斷分析。如仍為上述情況，需要在FISH報(bào)告中備注：此類患者HER-2狀態(tài)的判斷需結(jié)合IHC結(jié)果。(4)HER-2/CEP17比值≥2.0；平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥4.0判為FISH陽(yáng)性。若平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0則增加計(jì)數(shù)細(xì)胞，如果結(jié)果維持不變，則判為FISH陰性。目前對(duì)于平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0判為FISH陽(yáng)性尚有一些爭(zhēng)議，建議臨床醫(yī)師重復(fù)閱片或增加一名臨床醫(yī)師閱片，結(jié)果參考IHC檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)對(duì)患者進(jìn)行溝通。

1.4.3ddPCR的結(jié)果判讀 用CNV表示HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞的比值，CNV≥3.2為陽(yáng)性，CNV<3.2為陰性[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)穿刺標(biāo)本和手術(shù)根治標(biāo)本行ddPCR檢測(cè)與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)HER-2結(jié)果符合率用κ法分析其一致性；κ>0.75，P<0.01，認(rèn)為兩法檢驗(yàn)一致性較好。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌新輔助化療前的穿刺活檢標(biāo)本結(jié)果

2.1.1穿刺活檢標(biāo)本HER-2的檢測(cè)結(jié)果 62例穿刺活檢標(biāo)本中，IHC檢測(cè)結(jié)果HER-2陰性有33例，可疑陽(yáng)性有15例，陽(yáng)性有14例(圖1)；HER-2可疑陽(yáng)性標(biāo)本FISH檢測(cè)有9例為陰性，6例為陽(yáng)性(圖2)；即IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)HER-2陰性有42例，陽(yáng)性有20例。ddPCR檢測(cè)HER-2陰性有37例，陽(yáng)性有25例(圖3)。

2.1.2穿刺活檢標(biāo)本的ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)HER-2結(jié)果對(duì)比 穿刺活檢標(biāo)本HER-2檢測(cè)結(jié)果：ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)均為陽(yáng)性有19例，均為陰性有36例；其中6例ddPCR檢測(cè)陽(yáng)性，而IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)為陰性；1例ddPCR檢測(cè)陰性，IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)為陽(yáng)性。兩種方法檢測(cè)結(jié)果，一致性好(κ=0.758，P<0.01，表1)。

表1 穿刺活檢標(biāo)本的ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)HER-2結(jié)果對(duì)比

2.2 乳腺癌新輔助化療后的手術(shù)根治標(biāo)本結(jié)果

2.2.1手術(shù)根治標(biāo)本HER-2的檢測(cè)結(jié)果 62例手術(shù)根治標(biāo)本中，IHC檢測(cè)HER-2陰性有25例，可疑陽(yáng)性有23例，陽(yáng)性有14例；HER-2可疑陽(yáng)性標(biāo)本FISH檢測(cè)有17例為陰性，6例為陽(yáng)性；即IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)HER-2陰性有42例，陽(yáng)性有20例。ddPCR檢測(cè)HER-2陰性有40例，陽(yáng)性有22例(圖4)。

圖1 IHC染色HER-2結(jié)果：A.0；B.1+；C.2+；D.3+ 圖2 FISH檢測(cè)HER-2結(jié)果；紅色信號(hào)為HER-2基因，綠色信號(hào)為17號(hào)染色體；A.HER-2陰性；B.HER-2陽(yáng)性；C.HER-2可疑陽(yáng)性需參考IHC結(jié)果；D.HER-2簇狀陽(yáng)性

圖3 ddPCR法檢測(cè)穿刺活檢標(biāo)本HER-2的結(jié)果

圖4 ddPCR法檢測(cè)手術(shù)根治標(biāo)本HER-2的結(jié)果

2.2.2手術(shù)根治標(biāo)本的ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)HER-2結(jié)果對(duì)比 手術(shù)根治標(biāo)本HER-2檢測(cè)結(jié)果：ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)均為陽(yáng)性有18例，均為陰性有38例；其中4例ddPCR檢測(cè)陽(yáng)性，IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)為陰性；2例ddPCR檢測(cè)為陰性，IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)為陽(yáng)性。兩種方法檢測(cè)結(jié)果，一致性好(κ=0.784，P<0.01，表2)。

表2 手術(shù)根治標(biāo)本的ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)HER-2結(jié)果對(duì)比

3 討論

HER-2和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，是乳腺癌用于預(yù)后的重要判斷因子及靶點(diǎn)治療的指標(biāo)，因此HER-2狀態(tài)的檢測(cè)在臨床中顯得尤為重要。尤其對(duì)篩選靶向藥物獲益患者尤為重要[8]，有利于乳腺癌患者的個(gè)體化治療。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌新輔助化療前后的標(biāo)本行ddPCR與IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)HER-2的結(jié)果一致性好。IHC是通過檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)各種抗原物質(zhì)的一種檢測(cè)方法，具有快速簡(jiǎn)便、特異性好、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，但結(jié)果易受到內(nèi)環(huán)境溫度、抗體滴度、人為操作、病理醫(yī)師的主觀判讀等因素影響造成假陰性或假陽(yáng)性。FISH雖然相對(duì)穩(wěn)定但檢測(cè)費(fèi)用較高、熒光易淬滅且操作繁瑣，容易造成信號(hào)丟失導(dǎo)致結(jié)果假陰性；除此之外，有研究顯示，部分乳腺癌中17號(hào)染色體存在著HER-2基因和著絲粒的共同擴(kuò)增[9]，導(dǎo)致醫(yī)師在判讀中受到一定影響。而ddPCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信且操作簡(jiǎn)單、方便快速、結(jié)果直觀明了，大幅度降低了病理醫(yī)師的工作量。

另外本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)部分標(biāo)本存在結(jié)果差異性，特別是穿刺標(biāo)本中有6例ddPCR檢測(cè)為陽(yáng)性，IHC聯(lián)合FISH檢測(cè)為陰性；導(dǎo)致的原因主要有：(1)主要依靠臨床醫(yī)師根據(jù)B超的定位進(jìn)行穿刺，具有一定的主觀局限性；(2)細(xì)胞數(shù)量少或腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性，導(dǎo)致檢測(cè)樣本無法進(jìn)行刮取有效的腫瘤細(xì)胞且不可避免取到緊鄰腫瘤組織的正常組織或炎癥細(xì)胞；因此產(chǎn)生其結(jié)果的差異性。由于本次實(shí)驗(yàn)樣本量有限，需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行大樣本量的分析，進(jìn)一步論證行ddPCR檢測(cè)HER-2結(jié)果的可靠性。

綜上所述，在乳腺癌新輔助化療中采用ddPCR技術(shù)檢測(cè)HER-2基因是可行的。盡管IHC染色快速簡(jiǎn)便、易保存、費(fèi)用低但檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性仍需提高；FISH檢測(cè)準(zhǔn)確性較高，但耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣且熒光易淬滅，不易長(zhǎng)期保存；ddPCR技術(shù)則彌補(bǔ)了IHC和FISH的局限性，并且快速簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、結(jié)果直觀，因此對(duì)IHC與FISH檢測(cè)結(jié)果不一致性時(shí)[10]，臨床及病理科可以運(yùn)用ddPCR技術(shù)加以驗(yàn)證此標(biāo)本中HER-2基因的擴(kuò)增狀態(tài)。但由于本實(shí)驗(yàn)納入檢測(cè)標(biāo)本有限，仍需要擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量，為臨床提供更有力的證據(jù)。