一份水稻OsWOX3B基因敲除突變體的鑒定

鄭亞莉 余林闖 安肖肖 程心樂 任麗君 蘇子龍 鄭小雅 蘭濤, 2, 3, *?

一份水稻基因敲除突變體的鑒定

鄭亞莉1余林闖1安肖肖1程心樂1任麗君1蘇子龍1鄭小雅1蘭濤1, 2, 3, *?

(1福建農林大學 作物遺傳育種與綜合利用省部共建教育部重點實驗室, 福州 350002;2福建農林大學 作物應用遺傳學福建省高校重點實驗室, 福州 350002;3福建農林大學 福建省作物設計育種重點實驗室, 福州 350002;*通信聯系人, E-mail: tlan@fafu.edu.cn)

水稻基因調控葉片形態和表皮毛發育，根據表型被命名為、、和等。深入了解基因對水稻發育調控的功能具有重要意義。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對秈稻品種R401的進行基因敲除。對所獲材料進行突變位點分析和表型分析，同時進行相關基因的表達分析。所獲材料的基因的編碼區第341位堿基由T變為C，第395－397位堿基缺失，其葉片和穎殼光滑，與突變體、、的表型相同，可確認其為突變體。除了與已報道的的功能缺失突變表型相關外，突變體也有新表型出現。與野生型R401相比，突變體表現為生育期延長、分蘗數減少、葉片變寬、稻穗變長和每穗粒數增多。同時，突變體的劍葉維管束增多，小維管束間距增大，2個水稻側生器官發育相關基因在突變體中的表達變化也與其表型變化一致。鑒定了一個新的水稻基因突變體，其影響水稻側生器官發育。

水稻；側生器官；維管束；生育期

水稻（L.）作為世界上最重要的糧食作物之一，為全球半數以上人口提供糧食來源。水稻產量是評價水稻品種優良的主要指標，為了進一步提高品種的產量潛力，育種家提出了理想株型的概念，其重要特征是分蘗減少，沒有無效分蘗，穗粒數多，莖稈粗壯和根系發達等[1]。而葉型、分蘗、穗分支等側生器官則是塑造水稻理想株型的重要性狀。因此，對控制葉型、分蘗、穗分支等側生器官發育的基因及其調控機理研究可為超高產育種提供新的材料基礎和理論基礎。

WUSCHEL相關的同源異型盒（WUSCHEL- related homeobox，WOX）家族是植物特有的一類轉錄因子家族，擬南芥中有15個成員，水稻中有13個成員[2]。在植物莖和根頂端分生區建成、側生器官發育、花器官形成和胚發育等方面發揮作用，尤其是在細胞增殖和分化較為旺盛區域發揮重要調控作用[3]。目前，已經報道了多個水稻基因的功能。是水稻不定根生長發育的關鍵調節因子，功能缺失導致主根變小、冠根數目減少甚至沒有，突變體未成熟就已經死亡。的過量表達使冠根提早產生、數目增加，同時在高位莖節甚至花序基部產生冠根[4-6]。（）基因編碼一個新的類WUS 同源異型蛋白，參與水稻莖尖分生組織和根頂端分生組織干細胞的分化和維持[7-8]。（）是控制水稻分蘗平衡生長所必需，突變體表現為主莖高度正常且穗較大、分蘗矮小且穗較小，分蘗節間縮短，節間細胞數目減少且細胞不伸長，且的活性和GA信號轉導有直接或間接的關系[9]。（）對水稻腋芽的形成是必需的，其功能缺失突變體的分蘗芽在發育過程中遭受破壞，不能形成分蘗，且的表達受細胞分裂素誘導[10]。可能通過調控細胞分裂素的合成影響水稻葉片維管束的分化和莖尖分生組織的維持，從而影響水稻葉片的早期發育[11]。和是橫向同源物，編碼相同的OsWOX3A轉錄因子，是赤霉素合成的負反饋調節因子，對水稻葉片維管束形成、小穗內外稃形態建成、分蘗和側根發育等多方面起重要作用[12-13]。OsWOX3A是的轉錄抑制因子，干擾后葉片卷曲糾結，缺少正常的葉舌、葉耳，可能參與水稻葉片的細胞生長和分化[14]。

水稻基因的功能已有報道，根據表型其被命名為[15-16]、[17]、[18]和[19]等?；虻膬群硬迦胍粋€大片段后產生突變體，其葉片的橫向發育不正常，主要有兩種表型，一種是窄葉，一種是略寬的分叉葉。前者是由于葉片的一半部分消失甚至全部消失，后者是由于葉片有兩個中脈，類似于兩片葉片發育時合并在一起[15]。此外，突變體還表現為多分蘗和半矮稈表型，其雌、雄配子體發育不正常，導致不育[15-16]。突變體、和都表現出葉片和種子穎殼上的表皮毛缺失[17-19]。另有報道，控制表皮毛起始，調控表皮毛延伸，OsWOX3B和HL6存在物理互作，且影響的轉錄，從而調控水稻表皮毛發育[20]。為了深入研究的功能，本研究利用基因編輯技術獲得突變體，所獲突變體的表型與以前報道的相關，但也有未報道的新表型。本研究豐富了水稻基因的功能，為進一步研究其調控水稻生長發育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

秈稻品種R401及以R401為背景的基因敲除株系作為試驗材料。

1.2 水稻OsWOX3B基因敲除載體構建、轉化和靶標位點修飾分析

采用CRISPR/Cas9基因編輯系統對進行基因敲除。首先從水稻數據庫網站(http://rice. plant biology.msu.edu)下載基因的CDS序列，根據基因敲除靶點序列設計原則，在其第1外顯子中間進行2個gRNA靶點序列的設計與合成。將溶解稀釋至10 μmol/L的gRNA靶點序列復性形成oligo二聚體后連接至Cas9/gRNA載體（北京唯尚立德公司，VK005-01），轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α中。挑取陽性單克隆，利用特定SQ 引物測序驗證，同時用Ⅰ和Ⅰ雙酶切驗證敲除載體構建是否成功。以秈稻品種R401為受體材料，利用農桿菌介導法進行雙靶標編輯載體的轉化試驗，該工作由武漢伯遠生物公司完成。

所獲T0代轉基因幼苗在光照培養箱煉苗7 d后移栽至塑料盒的泥土中。待植株長勢正常時取幼嫩葉片用SDS法抽提基因組DNA，以潮霉素引物Hyg566: 5′-GTGATTTCATATGCGCGATTGCTG-3′和5′-ACGAGTGCTGGGCGTCGGTTTCC-3′進行PCR擴增檢測。在兩靶點位置前后設計一對特異性引物5′-GCCACCGACGACACAAGAAAAC-3′和5′-GCCACGCGACATGATCGATTA-3′進行PCR擴增和測序，根據測序結果分析靶點修飾類型。

1.3 田間種植與表型鑒定

在福建農林大學水稻試驗田里種植純合的敲除突變體的T1代植株，以野生型R401為對照。在抽穗7 d左右劍葉平展后，選擇小區中間10株水稻，測量劍葉、倒2葉和倒3葉的葉長和葉寬，并觀測劍葉大維管束、小維管束以及大維管束間小維管束的數目。在成熟期，選擇小區中間10株水稻，調查分蘗數、株高、有效穗數、穗長、一次枝梗數、二次枝梗數、每穗粒數、結實率和千粒重等性狀。

表1 水稻OsWOX3B基因敲除T0代株系分子鑒定結果

1.4 掃描電鏡分析

將樣品放入現配的2.5%戊二醛溶液中，4 ℃下固定過夜。用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.2)漂洗樣品3次，每次15 min；用1%的鋨酸溶液(溶于0.1 mol/L的磷酸緩沖液)固定1.5 h；倒掉固定液，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.2)漂洗樣品3次，每次15 min；用30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇對樣品進行脫水置換，每種濃度處理15 min，再用100%的乙醇處理兩次，每次20 min；用乙醇/醋酸異戊酯混合液(=1/l)處理樣品30 min，再用純醋酸異戊酯處理樣品1.5 h；將樣品浸泡在50%﹑75%﹑90%叔丁醇溶液中各10 min。將樣品浸泡在100%叔丁醇中3次，每次10 min。將處理好的樣品放在金屬燒杯中，利用VFD-21S t-BuOH Freeze Dryer冷凍干燥儀干燥樣品。在Hitachi公司TM Plus-3030掃描電鏡上進行樣品的顯微觀察。

1.5 qRT-PCR分析

野生型R401和突變體各40株種植于育秧盤中，常規田間管理。2周后各供試材料選取長勢相近的6株，對葉片進行RNA提取和逆轉錄，3次生物學重復。利用Primer designing tool設計qRT-PCR引物，序列分別為：(5′-CAGCTCAC TACCACGTCCTT-3′，5′-CACCGTGCATAAGTGT AGCAA-3′)和：(5′-GAGCCTAATGAACCC GAACAGG-3′，5′-CTCTGCCGC TTCTCTGAAGT -3′)。以水稻基因為內參進行熒光定量PCR擴增，所得數據分析基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 水稻OsWOX3B基因敲除突變體的獲得

運用CRISPR/Cas9基因編輯技術對進行雙靶標敲除載體構建。選擇第一外顯子的兩段序列作為靶點序列，分別為5′-AGATGTACAGGGGAGGGCT-3′和5′-CGACC GCCAGAAGCTCCGCC-3′，以北京唯尚立德公司的VK005-01載體為框架載體，經過復性、連接、轉化、測序和酶切等步驟，成功構建了基因的雙靶標編輯載體。

將基因的雙靶標編輯載體送至武漢伯遠生物公司轉化，受體材料為秈稻品種R401。獲得18株轉化苗，潮霉素檢測結果均為陽性。對第1外顯子測序分析，結果顯示T0代中有12株發生編輯，其中2株為純合體，命名為（表1）。測序結果表明，兩株突變體的突變一致，其編碼區第341個堿基由T變為C，導致一個丙氨酸變成纈氨酸；第395－397處發生了3個堿基的缺失，導致一個絲氨酸的缺失，后續氨基酸序列依然正常（圖1）。這兩個突變位點都在靶標序列之后，產生的原因有待進一步深入研究。以R401為對照，在體式顯微鏡和掃描電鏡下觀察分蘗期突變體近軸面葉中部表皮毛，同時在體式顯微鏡下觀察突變體成熟種子。結果顯示，突變體的葉邊緣刺突缺失(圖2-B)，近軸面葉中部幾乎無表皮毛分布(圖2-D)，觀察的3個視野中宏毛數目為0（圖2-E）。突變體成熟種子穎殼的細絨毛退化消失(圖2-F)。葉片和穎殼表型與突變體//表型類似[18-20]。序列分析和表皮毛觀察說明該轉基因植株的確是的突變體。我們用該突變體來研究的突變對水稻的有關影響。

方框表示外顯子，線段表示內含子，箭頭表示突變位點和結構域。

A、B和E表示野生型R401和純合突變株分蘗期葉片及成熟種子體式顯微鏡觀察結果；C、D表示野生型R401和純合突變株分蘗期葉片掃描電鏡觀察結果，箭頭所指為宏毛。F?R401和oswox3b近軸面葉中部宏毛數目統計結果。柱形圖上的數據點為平均值±標準差（n=3）。*表示突變體在P<0.05水平差異顯著。

2.2 水稻OsWOX3B基因通過調控維管束發育而影響葉寬

在田間栽培條件下，突變體的葉片比野生型R401的葉片寬且短（圖3-A~C）。抽穗期測量野生型和突變體的劍葉、倒2葉和倒3葉的葉寬和葉長。結果顯示，突變體的劍葉、倒2葉和倒3葉的葉寬分別為2.4 cm、2.2 cm和1.9 cm，而野生型R401的相應葉寬分別為1.6 cm、1.3 cm和1.1 cm，突變體皆顯著寬于野生型（圖3-D）。突變體的劍葉、倒2葉和倒3葉的葉長分別為31.9 cm、44.7 cm和50.01 cm，而野生型R401的相應葉長分別為50.4 cm、57.6 cm和52.42 cm，突變體的劍葉和倒2葉顯著短于野生型，倒3葉的葉長差異不顯著（圖3-E）。

抽穗期對野生型R401與突變體葉片進行掃描電鏡觀察（圖4-A~B）。結果顯示，突變體的劍葉、倒2葉和倒3葉的大維管束數目為12.7、11.0和9.4，而野生型R401的相應葉片的大維管束數目為9.6、7.9和6.7，突變體皆顯著多于野生型（圖4-C）。突變體的劍葉中相鄰兩個大維管束之間小維管束的數目為6.3，而野生型R401為5.6，突變體劍葉中小維管束總數為73.8，而野生型R401為54.2，兩者差異均顯著（圖4-D~E）；與野生型R401相比，突變體的劍葉中相鄰兩個小維管束之間的距離較大，差異顯著（圖4-A~B、F）。

由上可知，突變體葉片變寬是由于葉片維管束數目增多引起的。為進一步驗證的葉片變寬是由維管束發育引起的，我們用qRT- PCR做了相關基因的表達分析。在維管束發育和葉片形成中發揮重要作用，可作為葉片維管束發育的分子標記物[21]；對植物側生組織的形成和分生組織的功能行使有著重要作用[22]。結果顯示，在突變體中，這些基因的表達量約為野生型R401的兩倍左右，差異顯著（圖5）。

A、B?抽穗期野生型（A）與突變體（B）葉片大維管束之間小維管束掃描電鏡觀察結果，白色三角形代表小維管束；C?抽穗期大維管束數目統計分析；D?抽穗期劍葉大維管束之間小維管束數目；E?抽穗期劍葉小維管束總數；F?抽穗期劍葉小維管束間的距離。柱形圖上的數據點為平均值±標準差（n=10）；*表示突變體在P<0.05水平差異顯著。

柱形圖上的數據點為平均值±標準差（n=3），*表示突變體在P<0.05水平差異顯著。

2.3 水稻OsWOX3B基因影響了生育期、分蘗數和穗型

與野生型R401相比，突變體表現出生長緩慢和抽穗延遲的特點（圖6）。在芽期（催芽5 d后），突變體的芽長與根長明顯短于野生型R401（圖6-A、C）；在幼苗期，野生型R401處于3葉1心期時，而突變體為2葉1心期，且株高低于野生型R401（圖6-B~C）；正常田間管理條件下，野生型R401在播種后56 d時進入抽穗期，而突變體在播種后71 d時進入抽穗期，突變體開始抽穗時，野生型R401已處于灌漿后期（圖6-D）。

在抽穗期，與野生型R401相比，突變體的分蘗數顯著減少（圖7-A、C），突變體的總分蘗數和有效分蘗數分別為2.9和2.5，而野生型R401分別為7.9和6.6，突變體皆顯著少于野生型（圖7-C）。在成熟期對野生型R401和突變體的穗型和千粒重等性狀進行調查和統計分析。結果表明，突變體的穗長為27.5 cm，而野生型R401為21.2 cm，突變體顯著長于野生型（圖7-B、D）；突變體的一次枝梗數為15，二次枝梗數為59，每穗粒數為238，而野生型R401分別為12、51和186，突變體皆顯著多于野生型（圖7-E~G）。

A和B分別表示芽期和幼苗期野生型與突變體；C?芽長、根長和幼苗株高；D?抽穗期野生型與突變體植株的田間表型。柱形圖上的數據點為平均值±標準差（n=10），*表示突變體在P<0.05水平差異顯著。

A?抽穗期野生型R401與突變體Oswox3b的植株表型；B?野生型R401與突變體Oswox3b穗形比較（比例尺為15 cm）；C?抽穗期野生型R401與突變體Oswox3b分蘗數目和株高，B中TT為總分蘗數，ET為有效分蘗數；D~G分別為野生型與突變體穗長，一次枝梗數，二次枝梗數和每穗總粒數的統計分析。柱形圖上的數據點為平均值±標準差（n=10），*表示突變體在P<0.05水平差異顯著。

3 討論

基因的功能已有報道，根據表型特征其被命名為[15-16]、[17]、[18]和[19]等。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對秈稻品種R401的進行基因敲除，導致其編碼區第341個堿基由T變為C，第395－397個堿基缺失（圖1）。在抽穗期，突變體的劍葉和倒2葉的葉長顯著短于野生型，而突變體的劍葉、倒2葉和倒3葉的葉寬皆顯著寬于野生型（圖3）。以前報道的基因的突變體在葉片方面有兩種主要表型，一種是窄葉，一種是略寬的分叉葉（bifurcated leaf）。前者是由于葉片的一半部分消失甚至全部消失，后者是由于葉片有兩個中脈，類似于兩片葉片發育時合并在一起，總之都屬于葉片的橫向生長發育不正常[15]。經圖位克隆發現突變是由于基因的內含子有一個大片段插入[16]。本研究突變體的葉寬只有變寬一種表型，且是由于葉片的維管束數目增多和維管束之間距離增大引起的（圖4）。和的葉片表型雖略有差異，但都屬于葉片的橫向生長發育不正常。

其他性狀方面，突變體與的表型也略有不同。在抽穗期，突變體的分蘗數與野生型R401相比顯著減少，株高未發生顯著改變(圖7)，而突變體表現為多分蘗和半矮稈[15]。突變體表現出生長緩慢，導致生育期延長(圖6)，且結實率與野生型無異，而突變體與其野生型的生長速度一致，但其雌、雄配子體發育不正常，表現為不育[15-16]。在成熟期，突變體的穗長顯著長于野生型，突變體的一次枝梗數、二次枝梗數和每穗粒數皆多于野生型（圖7）。綜上所述，突變體與都屬于基因的突變體，突變位點和類型不同，應該屬于等位基因，表型有相似之處，也有不同存在。這種表型相關卻有所差異的現象也許和基因家族功能的復雜性有關。例如突變體的不同植株之間的表型也有所差異[15]，的同源基因過量表達也會出現不同表型，有的出現扭曲、打結的葉片，同時無葉耳和葉舌[14]；有的表現為葉脈數增多導致的葉片變寬[23]；有的表型為葉片變短且寬，同時株高顯著降低[12]。另外，這種表型相關卻有所差異的現象也許和基因組背景（品種）不同有關，比如[17]、[18]和[19]等基因都被確認為基因，而它們只報道了葉片和穎殼光滑一種表型。所以，基因調控水稻葉片和其他性狀發育的機制應該比較復雜，值得進一步深入研究。

水稻中維管束的發育和分布會影響葉寬[24-25]。水稻的反義轉基因植株葉片變窄，其通過調控維管束發育在水稻葉片形成中發揮重要作用[21]。水稻突變后小花的分生組織提前終止，其調控水稻側生器官發育和分生組織保持，在穗發育方面扮演重要角色[22]。本研究中，這2個基因在突變體中的表達量約為野生型R401的兩倍左右，突變體的表型與這2個正調控基因的表達量變化趨勢一致。本研究中突變體葉片變寬主要是由于葉片中大、小維管束數目增多，且小維管束間的距離變寬導致。推測是通過調控維管束發育從而影響水稻葉寬，同時也對分蘗、穗型等側生器官發育產生影響。

也被稱為，水稻基因家族中與序列相似性最高的是[26]?；虬▋蓚€重復基因，分別為第11染色體上的和第12染色體上的，/雙突變體表現為狹窄卷曲葉、多分蘗、少側根、開裂的小穗和窄細籽粒等表型[13, 23]，也調控根毛的形成[27]。可見主要調控器官的橫向生長和側生器官的生長，也表現出多效性，且其功能與相似。目前，已在水稻中發現了多個基因，其功能也與側生器官發育有關，如OsWOX11是水稻不定根生長發育的關鍵調節因子[4-6]，編碼一個WOX蛋白家族成員，促進腋芽的形成[10]。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術創制了突變體。結果表明，突變體的表型與已有報道相關，但也有新表型出現，其影響了多個側生器官的發育。本研究創制了基因的一個新的等位突變，為水稻基因調控側生器官發育的深入研究奠定基礎。

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Identification of a Knockout Mutant ofGene in Rice (L.)

ZHENG Yali1, YU Linchuang1, AN Xiaoxiao1, CHENG Xinle1, REN Lijun1, SU Zilong1, ZHENG Xiaoya1,LAN Tao1, 2, 3, *

(1Key Laboratory of Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Ministry of Education, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2Key Laboratory of Applied Genetics of Universities in Fujian Province, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;3Fujian Provincial Key Laboratory of Crop Breeding by Design, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;*Corresponding author, E-mail: tlan@fafu.edu.cn)

Thegene regulates leaf morphology and trichome development in rice. This study aims to further understand the role ofgene in regulating rice development.In this study,ofrice variety R401 was knocked out by CRISPR/Cas9 gene editing technique. The mutation sites and phenotype of the obtained materials were analyzed as well as the expression levels of related genes.The 341stbase of the coding region ofof the obtained plant was changed from T to C, and the 395th-397th bases were absent, and the leaves and glumes of the mutant were glabrous, the same as the phenotype of//. Therefore, the plant wasmutant. In addition to the reported loss-of-function phenotype of, new phenotypes ofwere found in this study. Compared with wild-type R401, mutantshowed prolonged growth duration, decreased tiller number, wider and shorter leaves, longer panicle and more grains per panicle. At the same time, the mutanthad increased number of vascular bundles in the blade, increased distance between the small vascular bundles. The changes in the expression levels of the two genes related to the development of lateral organs in the mutantwere also consistent with the phenotypic changes.A new mutant of ricegene was identified that affects lateral organ development in rice.

rice (L.); lateral organs; vascular bundle; growth duration

10.16819/j.1001-7216.2021.0602

2020-06-02；

2020-09-04。

國家自然科學基金資助項目(31671668)。