核酸適配體氯化血紅素比色法檢測牛奶中的氯霉素

孫懷霞，王令臣，林鄭忠，洪誠毅，黃志勇

(集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021)

0 引言

氯霉素(chloramphenicol,CAP)屬抑菌性廣譜抗生素，曾被用于漁業和畜牧業[1-2]。但是，長期攝入含CAP的食物會對人體產生骨髓抑制、再生性貧血及“灰色嬰兒綜合癥”等危害[3-4]。因此，歐盟規定，動物源食品中CAP不得檢出。2007年，我國農業部也宣布在獸醫學中禁止使用CAP[5]。因此，對CAP殘留的檢測至關重要。目前，CAP檢測方法有色譜法[6-9]、表面增強拉曼散射法[10]、分子印跡法[11]、化學發光芯片免疫法[12]、量子點修飾的電化學方法[13]、直接競爭酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[14]等。但這些方法由于操作繁瑣且耗時，儀器設備昂貴且還需要專業人員操作[15]。因此，建立一種快速、簡便的CAP檢測方法具有實際意義。

核酸適配體是通過體外配體指數級富集系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)從人工構建的寡核苷酸文庫中篩選出來的單鏈寡核苷酸序列[16]，具有結合范圍廣、成本低、毒性小和易于合成修飾[17]等優點，已應用于多種傳感檢測中，如電化學[18]、金納米粒子[19]、石墨烯材料[20-21]、熒光[22]和電化學發光[23]等。但是這些方法存在一些不足，例如熒光檢測實際樣品時背景熒光干擾嚴重，容易導致檢測結果假陽性[22]；電化學及電化學發光法需要對電極進行設計，可能會降低識別能力，檢測性能的穩定性難以保證[24]；石墨烯和金納米粒子結合適配體檢測方法制備可用的金納米粒子處理較為繁瑣，限制了其大規模應用[21]。因此，需要開發一種靈敏、簡便的適配體方法檢測CAP。

氯化血紅素(hemin)是許多天然酶重要的催化輔助因子，已被用于構建多種生物檢測方法[25]，其中包括具有過氧化物酶性質的G-四鏈體/hemin酶[26]和hemin-還原石墨烯-金復合材料的設計[27]。此外，由于hemin在水溶液中溶解性較差，易聚集成低催化活性的hemin二聚體，將其修飾在DNA上可顯著提高其溶解度，維持其單體結構以保持較高的催化活性[28]。

本文設計了一種基于適配體和hemin的比色方法，可用于快速檢測牛奶中的CAP含量。此方法以hemin為過氧化物模擬酶，通過調節其對四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)的氧化催化活性實現對CAP的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hemin-核酸適配體[29]序列為5′-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-hemin-3′，hemin-cDNA序列為5′-hemin-CTACCACCGACTCGC-3′，購自上海生工生物技術有限公司；CAP、四環素(tetracycline,TC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、金霉素(chlorotetracycline,CTC)、磺胺(sulfonic acid,SA)和TMB均購自百靈威科技有限公司；過氧化氫和氯化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；十二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·12H2O)、二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)和三水合乙酸鈉(NaAc·3H2O)購自西隴化工股份有限公司。DNA儲備液介質是磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.0，100 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L Na2HPO4)。反應緩沖液為HAc-NaAc(pH= 4.0，50 mmol/L HAc-NaAc，100 mmol/L NaCl)。反應終止液為2 mol H2SO4。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SpectraMax plus 384型酶標儀，美國Molecular Devices公司；PDA UV/VIS Lambda 265型紫外分光光度計，美國PerkinElmer公司；arium bagtank 50水純化系統，德國賽多利斯公司。

1.3 樣品預處理

牛奶樣品購自當地超市，并在分析前進行預處理。稱取牛奶試樣約2 g于10 mL離心管中，加4 mL乙腈，振蕩充分，13 000 r/min離心10 min，提取液置于離心管中，氮氣吹干。再用2 mL PBS溶解，加2 mL環己烷，充分振蕩后于13 000 r/min 離心10 min，棄上層(即正己烷層)以除去脂肪，取下層水相過膜后進樣分析[30-31]。

1.4 CAP檢測

將兩條DNA鏈在90 ℃退火10 min，在100 mmol/L PBS緩沖液中將等體積4 μmol/L的hemin-aptamer和hemin-cDNA溶液于室溫下混合反應20 min，獲得2 μmol/L的雙鏈DNA。取20 μL雙鏈DNA與不同濃度CAP于25 ℃孵育1 h，向其中加入TMB、H2O2和緩沖液至總體積為200 μL。由于TMB氧化顯色時間較長，難以達到穩定，因此，將反應溶液于25 ℃孵育15 min后立即加入50 μL H2SO4溶液(2 mol/L)以終止反應，加入H2SO4后溶液顏色由藍色轉變為黃色，最大吸收波長由652 nm 轉變為452 nm，記錄452 nm處溶液的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

此方法引入兩條hemin單體修飾的DNA鏈，在檢測體系中無CAP時，兩條DNA單鏈由于互補雜交形成DNA雙鏈，由于修飾在單鏈上的hemin單體相互靠近形成二聚體，使其過氧化物酶活性降低。而當體系中有CAP時，由于CAP與核酸適配體特異性結合，導致DNA雙鏈解離，hemin二聚體解聚成單體，過氧化物酶活性恢復，可有效催化H2O2氧化TMB，生成藍色氧化物，由溶液顏色深淺的變化可判斷CAP的含量，通過記錄452 nm處的吸光度值，實現CAP定量分析。

2.2 實驗可行性

如圖1所示，hemin單體(曲線a)在402 nm處顯示出吸收峰，修飾hemin的單鏈DNA(曲線b)在260 nm處顯示出DNA吸收峰和hemin單體吸收峰；而由適配體和互補鏈形成的DNA雙鏈(曲線c)在378 nm處出現一個新的吸收峰，此吸收峰為hemin二聚體的吸收峰，表明成功合成了DNA雙鏈。如圖2所示，當體系中無CAP存在時(曲線a)的吸光度值比有CAP存在時的(曲線b、c)低。同時，高濃度CAP(30 nmol/L) 所產生的吸光度值比低濃度CAP(5 nmol/L) 所產生的吸光度值大，表明所建立的方法可有效檢測CAP。

2.3 條件優化

實驗對hemin修飾的DNA濃度、緩沖體系的種類、緩沖液中Na+濃度、pH、TMB和H2O2的濃度分別進行了優化。考察1～5 μmol/L hemin修飾的DNA濃度對實驗的影響，發現DNA濃度越大，信號的吸光度值越大，但濃度為2 μmol/L時信號的吸光度值就可滿足檢測要求。為了節約成本，選擇hemin修飾的DNA濃度皆為2 μmol/L。實驗還考察了PBS、NaAc-HAc和4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖體系對實驗的影響發現，在NaAc-HAc緩沖液中，TMB被氧化顯色較理想，因此選擇緩沖液為NaAc-HAc。還對NaAc-HAc緩沖液中Na+濃度(50～200 mmol/L)進行了優化，當Na+濃度小于100 mmol/L時，DNA雙鏈結構不穩定；而Na+濃度太高時，雙鏈結合牢固，使得CAP很難與適配體結合。因此選擇Na+濃度為100 mmol/L。

NaAc-HAc緩沖液的pH值優化結果如圖3a所示，緩沖液pH值越大，反應溶液的吸光度值越小，而在pH=4.0時，吸光度值最大。可能原因是在此條件下，TMB被催化氧化更徹底。因此，緩沖液的pH值選擇4.0。TMB濃度對CAP檢測的影響如圖3b所示，TMB濃度越大，溶液吸光度值越大，而當TMB濃度高于0.9 mmol/L時，溶液的吸光度值開始減小，這可能是TMB 在水溶液中溶解度較低，在一定范圍內，反應溶液的吸光度值隨TMB濃度增大而增大，而TMB過量時不能充分溶解，導致其吸光度值減小。因此，實驗選擇TMB的濃度為0.9 mmol/L。圖3c為H2O2濃度對CAP檢測的影響，隨著H2O2濃度從60 mmol/L增加到140 mmol/L，溶液的吸光度值先增大后減小，當H2O2濃度為100 mmol/L時，溶液的吸光度值最大。因此，選擇H2O2濃度為100 mmol/L。

2.4 線性關系

實驗考察了1～30 nmol/L范圍內CAP濃度與溶液吸光度值的響應關系，如圖4a所示，隨著CAP濃度增加，溶液在452 nm處的吸光度值也逐漸增加。圖4b表明，CAP在1～30 nmol/L范圍內，吸光度值與CAP濃度呈現良好的線性關系，線性方程為y=0.019 9x+1.223，相關系數R2=0.976，檢出限為0.315 nmol/L(3σ，n=9)。

如表1 所示，與色譜法、表面增強拉曼散射法、直接競爭ELISA法、分子印跡法、化學發光免疫以及其他基于適配體的檢測方法相比，本方法具有較低的檢測限，線性范圍較寬，實驗過程也較為簡便快速，可用于痕量CAP的檢測。

表1 本方法與其他CAP檢測方法的比較

2.5 選擇性和干擾

為了分析所建立的方法對CAP的選擇性，實驗選取TC、OTC、CTC和SA等常見抗生素，考察其對探針的響應程度。將CAP濃度設為30 nmol/L，而其他抗生素的濃度均為60 nmol/L。圖5的結果表明，除了CAP，其他抗生素的信號響應都較低。而當加入CAP時，吸光度值增大，說明此方法對CAP檢測有良好的選擇性。將其他抗生素與CAP混合且濃度均設為30 nmol/L，混合液的吸光度值與單獨檢測CAP的吸光度值相近，表明其他物質對CAP的檢測沒有產生明顯的干擾。

2.6 實際樣品檢測

為了考察此方法在實際樣品中檢測CAP的性能，實驗選取了市售牛奶樣品進行試驗，結果未檢出。對該樣品進行加標回收試驗，選取4個加標水平，每個水平平行3份，結果如表2所示，牛奶樣品中CAP的加標回收率為95.5%～116.0%，表明該方法可用于牛奶樣品中CAP的檢測。

表2 牛奶樣品中CAP的回收率

3 結論

通過加入CAP可調節修飾在DNA鏈中的氯化血紅素的過氧化物酶活性，進而通過酶催化TMB與H2O2的氧化反應快速檢測CAP。在優化條件下，CAP檢測的線性范圍為1～30 nmol/L，檢測限為0.315 nmol/L，在牛奶樣品中的加標回收率為95.5%～116.0%，表明所建立的方法快速、準確。