應用TLC-CMS-IR 技術檢測北芪菇中黃芪甲苷

楊衛民，杜京旗，劉 猛，賴靜茹，劉慧敏

（呂梁林果植物化學省市共建山西省重點實驗室培育基地；山西省特色植物功能成分工程研究中心，呂梁學院，山西呂梁 033001）

正北芪，又稱恒山黃芪，地理標志為“渾源正北芪”。中國著名藥物學家李時珍在《本草綱目》中把“正北芪”列為上品，為中國北芪之正宗。正北芪富含蔗糖、葡萄糖、淀粉、黏液質、葉酸、甜茶堿、膽堿、樹膠、纖維素及多種氨基酸，具有瀉陰火、益正氣、壯脾胃、去肌熱、排膿止痛、活血醫瘡等功能。北芪菇的命名是依據中醫藥學“藥食同源”的記載，將正北芪、多種中草藥、農作物副產品作培養料，采用科學的配方和特殊的工藝培育而成的新型菌類產品，故命名為“北芪菇”[1-2]。經過山西省醫藥研究所化驗檢測和權威專家進行鑒定，發現北芪菇中含有多種人體所需的微量元素、維生素、礦物質，是一種食用菌。長期食用北芪菇可以充分補充人體所需的一些營養物質，是人們健康實用的美味佳品。分析化驗顯示，北芪菇的營養價值是任何動物食品、植物食品不能比擬的。其高蛋白、低脂肪、礦質元素（硫、鐵、鉀、硒）、維生素（硫胺素、核黃素、煙酸）等都是人體良好的營養源。其代謝產物具有極高的藥用價值，有抗腫瘤的多糖蛋白，有抗菌作用的抗生素，有降低血壓、防治腦血管障礙的微量牛黃酸，還有有利于胃腸作用的菌糖、甘露糖和幫助消化的各種酶等。特別是北芪菇內含有特殊功能的高倍量硒化物多糖，是普通蘑菇所不具有的。北芪菇可以治療牛皮癬，早在1992、1993 年光明日報就對此作了2 次詳細的報道[3-4]。

黃芪甲苷是環阿爾廷型三萜皂苷類化合物，是中藥黃芪中的有效成分之一，其含量的高低是評價黃芪質量好壞的主要標準。其植物來源是來自于豆科亞歷山大黃芪（Astragalus alexandrinus Boiss）的根，深裂黃芪（Astragalus dissectus）的根，膜莢黃芪（Astr-agalus membranaceus（Fisch.）Bungede）的根，綿毛黃芪（Astragalus sieversianus Pall.）的根，多刺黃芪（Astragalus spinosus Vahl）地上部分[5]。黃芪甲苷不僅具有黃芪多糖的作用，還有許多是黃芪多糖無法比擬的作用，其藥效強度是常規黃芪多糖的2 倍多，抗病毒作用更是黃芪多糖的30 倍。由于含量少、效果好，更是有“超級黃芪多糖”之稱。主要具有增強機體免疫力、提高機體的抗病能力、抗病毒作用、抗應激功效和作為促生長劑的作用，此外黃芪甲苷還具有改善心肺的功能[6-11]。

有關北芪菇的化學成分研究方法有多種，大致有超濾法、高速離心法，水提取法、回流法、超聲提取法、水提醇法，甲醇提取法、酸性乙醇提取法、乙醇提取法、乙醚提取法等。最好的黃芪甲苷的提取方法是乙醇提取法，這種提取方法可以將甲苷的提取率增值到最大[12-19]。至今有關運用TLC- CMS 聯用測定北芪菇中的黃芪甲苷還沒有，以北芪菇作為原料，利用薄層色譜法制備提取生物活性物質，采用質譜、紅外對其進行表征與分析。應用Plate ExpressTM 技術可直接從TLC 薄層板上獲取質譜圖，其優點是不經過樣品前處理，可快速從復雜混合物中獲得目標物分子質量信息，并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北芪菇和黃芪，山西省渾源縣恒山北芪菇專業合作社提供。

乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇、無水乙醇、石油醚、濃硫酸（均為分析純）；色譜甲醇，美國Fisher 提供；硅膠高效 G 板；黃芪甲苷 （CAS:84687-42-3），上海麥克林生化科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

ALB-224 型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；XH-300B 型微波-超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發展有限公司產品；KH-3000Plus 型薄層色譜儀，上海科哲生化科技有限公司產品；Expressions 型質譜儀，Plate ExpressTLS-型質譜接口，美國Advion 公司產品；Tensor-11 型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 北芪菇中黃芪甲苷的提取

將北芪菇和正北芪干燥粉碎，過80 目篩，取10 g 置于70%乙醇250 mL 溶液中振蕩，于50 ℃下浸提24 h。

超聲波微波萃取儀分3 個階段提取，每階段5 min，共15 min。在超聲波恒定的條件下，設置溫度為45，50，55 ℃；超聲功率為800，900，1 000 W；微波功率為250，300，350 W；超聲頻率為50 kHz，模式15∶10，電機轉速900 r/min。

將提取液以轉速4 000 r/min 離心10 min，3 次，合并上清液、過濾、濃縮至體積的1/10。

石油醚去雜后，用飽和正丁醇萃取3 次[20-21]，合并上層溶液、濃縮至無液體溢出時用甲醇（色譜純）將其定容至10 mL。備用。

標準品的制備：稱取黃芪甲苷20 mg 標準品置于10 mL 容量瓶中，用色譜甲醇定容，超聲條件下溶解后分別得到2 mg/mL 的黃芪皂苷Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ標準品，置于2～4 ℃的冰箱中保存。備用。

1.3.2 薄層色譜技術分離與制備

（1）點樣。用微量進樣器緩慢吸取25 μL 黃芪甲苷對照品溶液，置于全自動點樣機上，設置點樣參數（點樣間距10 mm，點樣寬度8 mm，點樣數目4，點樣量分別為 2，4，6 μL，點樣速度 5 s/μL），在聚酰胺薄層板上進行點樣，在吸取25 μL 供試品溶液，點樣20 μL。

（2）展開。在層析缸中配制北芪菇和黃芪的展開劑，分別為氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水= 13∶7∶2∶2 和氯仿∶甲醇∶水= 13∶7∶2，蓋上蓋子搖晃混勻，靜置20 min，將已點樣的薄層板放入展開缸內，待距薄層板頂端約1 cm 處時，取出晾干，于通風口處，并噴10%硫酸乙醇顯色劑在105 ℃下高溫顯色。

（3）成像。將顯色后的層析板放入薄層色譜成像系統，于波長365 nm 處紫外光燈下拍照觀察層析情況，并拍照記錄。

1.3.3 質譜和紅外質譜檢測方法

（1）質譜檢測方法。用色譜甲醇和超純水作為流動相。將儀器和軟件打開使其處于工作狀態，用微量進樣器吸取10 μL 的黃芪甲苷標準品溶液插入到進樣口處，打到Load 檔開始進樣，進完樣后打回到Inject 檔。點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

（2）待測液的質譜檢測。流動相與測標準品的流動相相同。使儀器和軟件處于工作狀態，將待測品薄層板置于TLC-質譜接口上，使激光對準圈出的硒代蛋氨酸斑點中心處。用軟件操作進行取樣，點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

待測樣品質譜檢測方法與黃芪甲苷標準品的質譜檢測方法相同。

（3）紅外檢測方法。打開儀器選擇相應的工作界面，用擦鏡紙擦干凈點樣中心處，測試背景，再用毛細管吸取少量的黃芪甲苷標準品于點樣中心處，測試樣品，對譜圖界面出現的譜圖進行處理和分析。待測樣品的制備與待測樣品的質譜檢測方法相同；待測樣品的紅外檢測方法與黃芪甲苷標準品的檢測相同。

注：待測樣品溶液是指與黃芪甲苷標準品Rf 值相同的樣品斑點。

1.3.4 熔點儀/旋光儀進行物理表征檢測

用甲醇對旋光儀進行校正后，然后將待測溶液（用于質譜檢測的樣液）倒入，調節模式，測定黃芪甲苷的旋光度和比旋光度，記錄其數值及平均值。將待測溶液蒸發結晶后測定其熔點。

2 結果與分析

2.1 薄層圖像比對分析

北芪菇樣品與黃芪甲苷標準品的TLC 成像圖見圖1，正北芪樣品與黃芪甲苷標準瓶的TLC 成像圖見圖2。

圖1 北芪菇樣品與黃芪甲苷標準品的TLC 成像圖

圖2 正北芪樣品與黃芪甲苷標準瓶的TLC 成像圖

由圖1 可知，最佳展開劑為氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水= 13∶7∶2∶2（V/V），展開后，與黃芪甲苷標準品熒光斑點位置一致的熒光斑點為北芪菇中的黃芪甲苷，Rf 值為0.31。

由圖2 可知，最佳展開劑為氯仿∶甲醇∶水=13∶7∶∶2（V/V），展開后，與黃芪甲苷標準品熒光斑點位置一致的熒光斑點為正北芪中的黃芪甲苷，Rf 值為 0.31。

黃芪甲苷的結構式見圖3。

圖3 黃芪甲苷的結構式

2.2 質譜波譜分析

2.2.1 黃芪甲苷結構及理化性質

黃芪甲苷為環阿爾廷型三萜皂苷類化合物，白色至淡黃色粉末，mp29510～29610e；CAS 編號：83207-58-3，分子式：C41H68O14，分子量：784.970 2；白色至淡黃色粉末，熔點295.0～296.0 ℃；易溶于甲醇、乙醇、丙酮，難溶于氯仿、乙酸乙酯等弱極性有機溶劑。

2.2.2 黃芪甲苷質譜波譜分析

黃芪甲苷標準品的質譜波譜圖見圖4，北芪菇中黃芪甲苷的質譜波譜圖見圖5，正北芪中黃芪甲苷的質譜波譜圖見圖6。

圖4 黃芪甲苷標準品的質譜波譜圖

通過查閱相關文獻[20]可以得知，分子離子峰的識別首先是該離子峰范圍內最大的峰值（m/z），其次需要判斷該物質是否符合氮律，不含N 或含偶數N的有機分子，其分子離子峰的質荷比（即分子量）為偶數。含奇數N 的有機分子，其分子離子峰的質荷比（即分子量）為奇數，這兩點是識別離子峰的關鍵。黃芪甲苷的分子量為784.97，分子式為C41H68O14，結構式中不含N。從圖4、圖5 和圖6 可以觀察到，三者離子峰范圍內的最大峰值均為807.6，與黃芪甲苷的分子量相差約23，表示該物質在電子的轟擊下增加了一個Na 離子[M+Na+=807.97]，為合理性的增加，由此可以確定黃芪甲苷的離子峰為807.6。

圖5 北芪菇中黃芪甲苷的質譜波譜圖

圖6 正北芪中黃芪甲苷的質譜波譜圖

2.3 黃芪甲苷的紅外圖譜分析

黃芪甲苷標準品的紅外圖譜見圖7，北芪菇中黃芪甲苷的紅外波譜圖見圖8，正北芪中黃芪甲苷的紅外波譜圖見圖9。

圖7 黃芪甲苷標準品的紅外圖譜

通過查閱文獻[21]與分析圖7、圖8 和圖9，可以看到三者在1 600～1 700 cm-1有相似的峰，說明都含有苯環；在3 000～3 200 cm-1三者有相似的峰，說明都含有羥基；在2 900～3 000 cm-1有相似的峰，說明都含有-C-H 單鍵；在1 380 cm-1附近有相似的峰，說明都含有-CH3鍵；在1 000～1 500 cm-1有相似的峰，說明都含有C-O 單鍵；在700～1 000 cm-1之間有相似的峰，說明=C-H 彎曲振動吸收峰在三者中都具有，這些峰值基本符合黃芪甲苷結構的特征峰。

圖8 北芪菇中黃芪甲苷的紅外波譜圖

圖9 正北芪中黃芪甲苷的紅外波譜圖

結合質譜波譜特征，由此可以確定所測樣品是黃芪甲苷。

2.4 樣品熔點、旋光度和比旋光度分析

北芪菇中黃芪甲苷的熔點見表1。

表1 北芪菇中黃芪甲苷的熔點/℃

由表1 可知，北芪菇樣品與黃芪甲苷標準品熔點均為295 ℃，在熔點295.0～296.0 ℃內，而且易溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性溶劑。

北芪菇中黃芪甲苷的旋光度與比旋光度見表2。

表2 北芪菇中黃芪甲苷的旋光度與比旋光度

相關文獻記載，黃芪甲苷的旋光度：-56.6（c,0.13 in DMF），與北芪菇所測樣品基本一致。

3 結論

以恒山北芪菇為原料，乙醇-水（7∶3（V/V））為提取劑。微波超聲波萃取儀分3 個階段提取，每階段5 min，共15 min。在超聲波恒定的條件下，設置溫度為45，50，55 ℃，超聲功率為800，900，1 000 W，微波功率為250，300，350 W，超聲頻率為50 kHz，模式15∶10，電機轉速900 r/min。經多級萃取后獲得黃芪皂苷的正丁醇相。以氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=13∶7∶2∶2（V/V）為展開劑，薄層層析獲得的黃芪甲苷樣品熒光斑點顯色清晰，與黃芪甲苷標準品比對熒光斑點位置一致，其Rf 值為0.31。

質譜圖譜顯示，黃芪所測樣品的質荷比與黃芪甲苷標準品基本保持一致，質荷比均為807.6，與黃芪甲苷的分子量相差約23，表示該物質在電子的轟擊下增加了一個Na 離子[M+Na+=807.97]，為合理性的增加。紅外譜圖顯示，黃芪所測樣品所含官能團與黃芪甲苷標準品基本相同。

北芪菇樣品與黃芪甲苷標準品熔點均為295 ℃，在熔點295.0～296.0 ℃內，而且易溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性溶劑。黃芪甲苷的旋光度：-56.6（c,0.13 in DMF），與北芪菇所測樣品基本一致。

黃芪甲苷應用在醫學上可以治療牛皮蘚、增強機體免疫力、提高機體的抗病能力，還有抗病毒作用和抗應激功效；作為促生長劑、黃芪甲苷可改善心肺功能等[22-24]。然而，研究發現不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強的適應性，為從復雜的天然產物粗制品中提取不同特性的有效成分提供了有利條件。

TLC-MS-IR 聯用在北芪菇生物活性物質分離純化中具有操作簡便、容易掌握、回收率高、重現性好、分離效率高、分離量較大等特點，該技術有望在標準品的制備、天然產物化學成分研究及新藥篩選、評價、分析或質控需求等領域得到更廣泛的應用。