游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨退變和NF-κB激活的影響

蔡任，錢佳佳，許奇，許煒民，趙佩茹，袁嘉奇，李妍，黃桂成

摘要：目的：通過(guò)觀測(cè)游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）小鼠軟骨基質(zhì)降解及NF-質(zhì)降信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，探討游泳運(yùn)動(dòng)延緩KOA小鼠軟骨退變的分子機(jī)制。方法：3月齡C57BL/6小鼠40只，隨機(jī)分為空白組（Blank）、ACLT模型組（ACLT）、ACLT模型+游泳組（ACLT+Swim）、假手術(shù)組（Sham）和假手術(shù)+游泳組（Sham+Swim）。采用前交叉韌帶橫斷術(shù)（ACLT）制作KOA模型，手術(shù)2周后，游泳組小鼠進(jìn)行6周的無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)（40 min/d，5 d/周）。游泳結(jié)束后，取各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，HE染色觀察軟骨病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)軟骨中炎癥介質(zhì)表達(dá)、RT-PCR法檢測(cè)軟骨基質(zhì)相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)、Western blot技術(shù)檢測(cè)軟骨基質(zhì)及NF-κB通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)血清中炎癥指標(biāo)表達(dá)水平。結(jié)果：1）與空白組相比：ACLT組軟骨損傷明顯，Mankins評(píng)分顯著升高（P<0.01）;軟骨Col II含量顯著下降，而MMP-13表達(dá)增高（P<0.01）;軟骨中炎癥介質(zhì)COX-2、iNOS表達(dá)增高，血清炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)亦增高（P<0.01）;NF-κB通路中磷酸化p65、IκBα蛋白水平顯著升高（P<0.01）。2）與ACLT組相比：ACLT+Swim組Mankin′s評(píng)分明顯下降（P<0.01）Col IImRNA（P<0.05）及蛋白水平（P<0.01）均提升，MMP-13mRNA及蛋白水平均顯著下降（P<0.01），軟骨中炎癥介質(zhì)COX-2、iNOS及血清炎癥因子TNF-α、IL-6均顯著降低（P<0.01），p65、IκBα磷酸化水平亦明顯下降（P<0.01）。結(jié)論：中等強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制軟骨基質(zhì)降解從而延緩軟骨退變，干預(yù)KOA小鼠病理進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：游泳運(yùn)動(dòng);膝骨關(guān)節(jié)炎;軟骨退變;基質(zhì)降解;炎癥反應(yīng);核轉(zhuǎn)錄因子κB信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：G804.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-2076（2021）06-0025-09

Effects of swimming on cartilage degeneration and NF-κB activation in mice with knee osteoarthritis

CAI Ren1，QIAN Jiajia2，3，XU Qi2，XU Weimin2， ZHAO Peiru3，YUAN Jiaqi3，LI Yan3， HUANG Guicheng2

1.Dept.of Basic Physical Education，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，Jiangsu，China;2.Laboratory for New Techniques of Restoration & Reconstruction of Orthopedics and Traumatology， Nanjing 210023， Jiangsu，China;3.Dept. of Rehabilitation Therapy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， Jiangsu，China

Abstract：Objective：To observe the effect of swimming exercise with moderate intensity on cartilage matrix degradation and inflammatory response mediated by NF-κB signaling pathway in KOA mice， and to explore the molecular mechanism of swimming exercise delaying cartilage degeneration in KOA mice. Methods： 40 C57BL/6 mice aged 3 months were randomly divided into blank group （Blank）， ACLT model group （ACLT）， ACLT+swim group （ACLT+Swim）， sham operation group （Sham） and sham+swim group （Sham+Swim）. KOA model was made by anterior cruciate ligament transection （ACLT）， 2 weeks after the operation， mice in the swim group were swimming without weight for 6 weeks （40 min/D， 5d/week）. After swimming， the cartilage of knee joint of mice in each group was taken， and the pathological changes of cartilage were observed by HE staining. The expression of inflammatory mediators in cartilage was detected by immunohistochemical staining. The mRNA expression of cartilage matrix related indicators was detected by RT-PCR. The protein expression of cartilage matrix and NF-κB pathway related molecules was detected by Western blot. The expression level of inflammatory indicators in serum was detected by ELISA. Results： 1）Compared with the blank group， the cartilage injury in ACLT group was obvious， Mankin's score was significantly increased （P<0.01）; the content of Col II in cartilage was significantly decreased， but the expression of MMP-13 was increased （P<0.01）; the expression of COX-2 and iNOS in cartilage was increased， and the expression of TNF-α and IL-6 in serum was also increased （P<0.01）; the protein levels of phosphorylated p65 and IκBα in NF-κB pathway were significantly increased （P<0.01）. 2） Compared with ACLT group， Mankin's score decreased significantly （P<0.01）， Col IImRNA （P<0.05） and protein level （P<0.01） were both increased， MMP-13 mRNA and protein level decreased significantly （P<0.01）， COX-2， iNOS in cartilage and TNF-α， IL-6 in serum decreased significantly （P<0.01）， the level of p65 and IκBα phosphorylation decreased significantly （P<0.01） in ACLT+Swim group. Conclusion： Moderate intensity swimming can inhibit the degradation of cartilage matrix by regulating the inflammatory response mediated by NF-κB signaling pathway， thus delaying cartilage degeneration and intervening the pathological process of KOA mice. This study provides a theoretical and experimental basis for swimming assisted therapy of KOA.

Key words：swimming; KOA; cartilage degeneration; matrix degradation; inflammatory response; NF-κB signaling pathway

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis， OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨破壞和骨贅形成為特征的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是最常見的關(guān)節(jié)炎，也是老年人致殘的主要原因之一，常伴有關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)受限，影響工作和日常活動(dòng)。國(guó)際OA研究學(xué)會(huì)治療指南指出，目前針對(duì)KOA的治療方法主要是早期預(yù)防和癥狀緩解，到疾病晚期只能通過(guò)關(guān)節(jié)置換術(shù)減緩疾病的發(fā)展。但目前并沒有有效的治療方法可以真正改變骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程。因此，尋找一種切實(shí)可行的方法以更安全、更有效的早期預(yù)防和緩解癥狀對(duì)KOA的防治具有重要意義。美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì)建議將有氧運(yùn)動(dòng)納入KOA治療計(jì)劃，游泳因其負(fù)重小、實(shí)施方便等優(yōu)勢(shì)可作為中老年KOA患者理想的有氧運(yùn)動(dòng)形式。多項(xiàng)研究證實(shí)游泳可以改善骨關(guān)節(jié)炎癥狀、延緩KOA進(jìn)程，但有關(guān)游泳運(yùn)動(dòng)延緩KOA的分子機(jī)制研究較少。

II型膠原（Type II collagen，Col II）是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）的主要成分，而基質(zhì)金屬蛋白酶-13（Matrix Metalloproteinases-13，MMP-13）是與軟骨分解代謝相關(guān)的最重要的蛋白酶，在Col II降解中占有重要地位。有研究表明，早期游泳可顯著增加KOA大鼠軟骨中Col II表達(dá)同時(shí)抑制MMP-13的過(guò)度表達(dá)，減輕關(guān)節(jié)軟骨破壞，延緩OA進(jìn)程，但其具體分子機(jī)制仍未完全明了。

雖然骨關(guān)節(jié)炎通常被認(rèn)為是一種非炎癥性疾病，但越來(lái)越多的研究表明，炎性反應(yīng)參與了KOA的發(fā)生發(fā)展。核因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）信號(hào)通路作為經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，廣泛參與多種促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。NF-κB家族由一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的Rel蛋白家族組成，其中NF-κBp65二聚體是其最常見的形式，靜息狀態(tài)下，NF-κBp65（p65）與抑制亞單位IκBα結(jié)合以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，在受到各種化學(xué)因子、細(xì)胞因子信號(hào)刺激，如白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）過(guò)量分泌，和膝關(guān)節(jié)機(jī)械應(yīng)力改變時(shí)，IκBα磷酸化（p-IκBα）并發(fā)生降解，聚合物NF-κBp65磷酸化（phosphoNF-κBp65，p-p65）而被激活進(jìn)入核內(nèi)與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible Nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）、TNF-α、IL-6等炎癥物質(zhì)的DNA啟動(dòng)子特定位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)其基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控炎癥反應(yīng)及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解。其中，iNOS和COX-2可促進(jìn)MMP的產(chǎn)生和激活，抑制Col II和蛋白多糖的合成，使細(xì)胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致軟骨退化;TNF-α和IL-6可合成促炎性因子導(dǎo)致OA的炎性反應(yīng)。同時(shí)NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活，可持續(xù)刺激IL-6、TNF-α等促炎因子產(chǎn)生，反饋?zhàn)饔糜贜F-κB信號(hào)通路，進(jìn)一步導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨破壞，加速KOA發(fā)展。游泳運(yùn)動(dòng)是否可通過(guò)影響該信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控炎癥反應(yīng)以延緩KOA軟骨退變，目前未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究采用前交叉韌帶橫斷術(shù)（Anterior Cruciate Ligament Transection，ACLT）構(gòu)建KOA小鼠模型，并于術(shù)后2周實(shí)施中等強(qiáng)度的游泳運(yùn)動(dòng)，以觀察游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及軟骨基質(zhì)降解相關(guān)指標(biāo)的影響，探索游泳運(yùn)動(dòng)延緩KOA疾病進(jìn)程的作用機(jī)制，以期為游泳運(yùn)動(dòng)防治KOA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)健康3月齡C57BL/6小鼠40只（雌雄各半），體重（20±3）g，購(gòu)于山東斯科貝斯生物科技股份公司，許可證號(hào)SCXK（魯）20160001。在無(wú)特定病原體（SPF級(jí)）條件下常規(guī)喂養(yǎng)，12 h/12 h光暗交替，恒溫恒濕，使用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物水和食物。本研究所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：201904A009）。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組（Blank）、ACLT模型組（ACLT）、ACLT模型+游泳組（ACLT+Swim）、假手術(shù)組（Sham）、假手術(shù)+游泳組（Sham+Swim），每組8只。模型組采用ACLT建立手術(shù)誘導(dǎo)的KOA模型，手術(shù)方法如前所述，構(gòu)建輕度損傷模型。研究表明輕度損傷模型較適用于早期研究。假手術(shù)組僅暴露關(guān)節(jié)囊，不破壞韌帶。

1.2運(yùn)動(dòng)方案

造模完成2周后，ACLT模型+運(yùn)動(dòng)組和假手術(shù)+游泳組參照文獻(xiàn)中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)方案，進(jìn)行為期6周的無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。游泳項(xiàng)目包括兩個(gè)階段：適應(yīng)和訓(xùn)練（適應(yīng)旨在減少水誘導(dǎo)的壓力，而不促進(jìn)與體育鍛煉相關(guān)的生理變化），第一周為適應(yīng)階段：第一天15 min/次，第二天到第七天30 min/次;第二周至第六周為訓(xùn)練階段：40 min/次，1次/天，5次/周，共5周。空白組、模型組及假手術(shù)組常歸飼養(yǎng)不運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)結(jié)束后各組取材進(jìn)行各種測(cè)試。

1.3關(guān)節(jié)腫脹程度

在游泳訓(xùn)練開始前觀察模型組與假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)腫脹情況，并在訓(xùn)練結(jié)束后剔除各組小鼠右膝關(guān)節(jié)被毛，確定右側(cè)髕骨位置后，以髕骨中點(diǎn)為測(cè)量起止點(diǎn)，用黑色記號(hào)筆標(biāo)注術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)的周徑，然后測(cè)量標(biāo)記處長(zhǎng)度，即膝關(guān)節(jié)腫脹度，共測(cè)量3次，計(jì)算平均值作為該小鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度。

1.4蘇木精-伊紅（HE）染色檢測(cè)

4多聚甲醛中固定膝關(guān)節(jié)組織24 h，10EDTA脫鈣8周，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟浸漬、包埋，4 μm厚切片。采用蘇木精-伊紅染液試劑盒（KGA224）進(jìn)行染色（HE），每個(gè)切片隨機(jī)取3到5個(gè)視野，在400倍光鏡下觀察軟骨和軟骨細(xì)胞的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，并根據(jù)改良Mankins評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病理變化進(jìn)行評(píng)分，得分越高，說(shuō)明骨關(guān)節(jié)炎病變程度越高：0～1分為正常關(guān)節(jié)軟骨，2～5分為輕度病變，6～9分為中度病變，10～14分為重度病變。取3次評(píng)分均值作為最終評(píng)分。

1.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)

4 μm關(guān)節(jié)組織切片37℃脫蠟30 min，將切片用二甲苯、梯度酒精水化，PBS沖洗;將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復(fù)緩沖液的染色盒進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗;3H%2O2-甲醇溶液，室溫封閉10 min，PBS沖洗;滴加iNOS（Affinity AF0199）和COX-2兔抗鼠一抗試劑（Abcam ab179800），稀釋比例均為1∶100，4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗;滴加羊抗兔聚合物50 ul，室溫濕盒孵育20 min，PBS沖洗;滴加DAB顯色，顯微鏡下適時(shí)終止，自來(lái)水輕柔沖洗15 min;蘇木素復(fù)染10 min，0.1%HCl分化，自來(lái)水沖洗后返藍(lán);梯度酒精脫水，二甲苯浸泡后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，取3個(gè)高表達(dá)區(qū)域拍照保存（所有圖片均400×拍攝）。被染成棕褐或棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，被染成藍(lán)色為陰性細(xì)胞。

1.6Real-time PCR檢測(cè)

采用Trizol法提取小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒（日本TaKaRa RR036B）將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增以GAPDH作為內(nèi)參照，應(yīng)用熒光定量PCR循環(huán)儀（ABI Step one plus Real time-PCR system）進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，參數(shù)設(shè)置如下：95℃5 min，之后擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)（95℃15 s，60℃20 s，72℃40 s）。以GAPDH為內(nèi)參校正，采用2-△△Ct法求得目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCT（test）=CT（target，test）-CT（ref，test），ΔCT（calibrator）=CT（target，calibrator）-CT（ref，calibrator），ΔΔCT=ΔCT（test）-ΔCT（calibrator）。引物序列見表1。

1.7Western blot檢測(cè)

各組稱取100 mg關(guān)節(jié)軟骨組用骨頭鉗鉗碎，于研缽中加入5 ml液氮迅速研碎，加入1 ml預(yù)冷的Lysis Buffer（已加10 μL磷酸酶抑制劑，1 μL蛋白酶抑制劑和5 μL 100 mM PMSF混勻），10 000轉(zhuǎn)/min，4℃離心5 min，取上清。BCA試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，向各組上清中加入四分之一體積的5劑蛋白上樣緩沖液（Solarbio），混勻后100℃水浴加熱10 min，-20℃分裝保存。隨后進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)，10奶粉封閉2 h，TBST洗膜后分別加入一抗CoI II（北京博奧森 bs-10589R，1∶500）、MMP-13（北京博奧森 bs-0575R，1∶500）、p65（Abcam ab16502，1∶500）、p-p65（Abcam ab194726，1∶500）、IκBα（Abcam ab32518，1∶2000）、p-IκBα（CST 2859，1∶1000）4℃過(guò)夜，再次清洗后加入二抗，室溫孵育2 h清洗后ECL上機(jī)顯影。使用Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.8ELISA檢測(cè)

各組小鼠采用眼球取血收集循環(huán)血液，并提取血清。根據(jù)TNFα（凱基生物 KGEMC102a）和IL-6 ELISA（凱基生物 KGEMC004）試劑盒說(shuō)明書對(duì)各組血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.9數(shù)據(jù)處理與分析

本研究計(jì)量資料結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的方式表示，數(shù)據(jù)處理和作圖采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad Prism 8，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。其中P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有極顯著性差異。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1膝關(guān)節(jié)腫脹程度評(píng)估

造模后2周，大體觀察可見模型組小鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度（周徑）較假手術(shù)組明顯增加（見圖1A）;6周游泳運(yùn)動(dòng)后，與模型組相比，游泳組小鼠右膝關(guān)節(jié)的腫脹度顯著降低（P<0.01），分析結(jié)果見圖1B。

2.2游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)KOA小鼠軟骨病理變化的影響

根據(jù)周凱等關(guān)于鼠類膝骨關(guān)節(jié)炎分期的描述，0～1分為正常軟骨;2～6分為早期OA;7～10分為中期OA;11～14分為晚期OA。為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)小鼠早期造模是否成功，2周后通過(guò)光鏡下觀察軟骨變化情況，結(jié)果顯示造模后2周后ACLT模型組Mankin評(píng)分為2～4分，符合早期OA特征（圖2）。術(shù)后兩周，游泳組進(jìn)行為期6周的游泳訓(xùn)練，結(jié)束后取各組軟骨組織采用HE染色觀察軟骨病變情況，結(jié)果顯示空白組軟骨表層光滑平整，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常、分布均勻，排列整齊，潮線完整，基質(zhì)染色正常;ACLT模型組鏡下觀察為中度損傷，軟骨表面不光滑，細(xì)胞數(shù)目減少，潮線不完整;而ACLT+Swim組可見軟骨結(jié)構(gòu)趨于正常，軟骨細(xì)胞分布偶見不均，潮線連續(xù)度尚可;假手術(shù)組未見明顯變化（圖2）。同時(shí)用Mankin評(píng)分對(duì)各組病變程度進(jìn)行定量分析，可見ACLT組明顯高于空白組（P<0.01），而ACLT+Swim組的Mankin評(píng)分較模型組明顯降低（P<0.01），表明游泳運(yùn)動(dòng)可改善KOA小鼠軟骨損傷程度。

2.3游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)KOA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的影響

為觀察中等強(qiáng)度游泳對(duì)OA小鼠軟骨基質(zhì)降解的影響，采用RT-PCR法檢測(cè)軟骨中Col II、MMP-13的表達(dá)情況，如圖3A所示，與空白組相比，ACLT模型組小鼠軟骨組織中II型膠原mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01），而游泳可增加KOA小鼠軟骨中Col II的mRNA含量（P<0.05）。其次，模型組小鼠軟骨組織中MMP-13的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01），而游泳顯著降低了病變軟骨中MMP-13表達(dá)（P<0.01）。同時(shí)，對(duì)各組軟骨組織中總蛋白進(jìn)行蛋白印跡分析，Col II和MMP-13的蛋白水平變化與mRNA水平一致（圖3B）。假手術(shù)組無(wú)明顯變化。

2.4游泳運(yùn)動(dòng)抑制KOA小鼠軟骨NF-κB信號(hào)通路的作用

為了進(jìn)一步探討游泳抗炎作用的分子機(jī)制，采用western blot檢測(cè)了各組NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平。與對(duì)照組相比，ACLT模型組的IκBα的表達(dá)明顯降低而磷酸化IκBα（p-IκBα）水平顯著上調(diào)，p65及磷酸化p65（p-p65）表達(dá)均升（見圖4），表明OA小鼠軟骨中NF-κB信號(hào)通路顯著激活。而游泳運(yùn)動(dòng)可抑制IκBα和p65磷酸化，抑制NF-κB信號(hào)通路的活性，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)控KOA病理進(jìn)程。

2.5游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)KOA小鼠關(guān)節(jié)軟骨及血清炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響

為了觀察骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的炎癥反應(yīng)，采用免疫組化法檢測(cè)各組軟骨組織中COX-2和iNOS蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：正常軟骨中COX-2、iNOS也有陽(yáng)性表達(dá)，但僅局限在軟骨淺層區(qū)域，而ACLT模型組關(guān)節(jié)破壞明顯，COX-2和iNOS陽(yáng)性蛋白表達(dá)明顯提升，且到達(dá)深層結(jié)構(gòu)（見圖5A、B）。此外，為觀察各組循環(huán)血中炎癥因子的變化情況，采用ELISA試劑盒血清中TNF-α和IL-6進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示ACLT模型組與對(duì)照組相比，在蛋白質(zhì)水平上IL-6和TNF-α的產(chǎn)生均明顯增加（P<0.01）（見圖5C），印證OA與全身炎癥有關(guān)的理論。而6周游泳訓(xùn)練能顯著降低軟骨組織中iNOS和COX-2蛋白水平。同時(shí)，血清IL-6和TNF-α表達(dá)亦出現(xiàn)明顯下調(diào)。

3討論

3.1游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨退變的影響

美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì)建議將有氧運(yùn)動(dòng)納入骨關(guān)節(jié)炎治療計(jì)劃，但關(guān)節(jié)疼痛和僵硬等障礙對(duì)陸地負(fù)重活動(dòng)形成較大障礙。游泳是一種常見的有氧運(yùn)動(dòng)方式，水的浮力作用使患者只需承受最小負(fù)重應(yīng)力，同時(shí)，運(yùn)動(dòng)的持續(xù)時(shí)間和負(fù)荷相對(duì)可控，使得游泳成為中老年KOA患者理想的有氧運(yùn)動(dòng)形式。目前關(guān)于游泳運(yùn)動(dòng)治療膝骨關(guān)節(jié)炎的研究多從宏觀角度觀察其緩解疼痛，減輕腫脹，改善運(yùn)動(dòng)功能的作用。Yazigi等指出水上運(yùn)動(dòng)療法是由國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)（OARSI）推薦的一種可以有效控制膝骨關(guān)節(jié)炎癥狀的康復(fù)療法;Mohammed等研究表明，定期游泳鍛煉可減輕與KOA相關(guān)的關(guān)節(jié)疼痛和僵硬，并改善中老年KOA患者肌肉力量和功能活動(dòng)能力。一項(xiàng)回顧研究表明，游泳對(duì)膝關(guān)節(jié)健康有潛在的益處，尤其是在生命早期（35歲之前）游泳，但仍需更多的前瞻性研究來(lái)證實(shí)。迄今為止，尚缺乏游泳運(yùn)動(dòng)保護(hù)軟骨的作用及機(jī)制研究。小鼠是用來(lái)研究生理和病理?xiàng)l件下分子背景最理想的模型。前交叉韌帶橫斷術(shù)（ACLT）誘導(dǎo)的KOA模型是研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制和治療方法的成熟模型。研究表明，ACLT小鼠模型與人類骨關(guān)節(jié)炎改變非常相似，包括軟骨下骨改變、關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎，但目前未見游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)該模型的調(diào)控機(jī)制研究。本研究結(jié)果表明，游泳運(yùn)動(dòng)可顯著降低ACLT誘導(dǎo)的KOA小鼠軟骨中NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及軟骨基質(zhì)降解水平，減輕軟骨退變程度，進(jìn)而延緩KOA進(jìn)程。

KOA主要病變是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生。其最早期的病理變化發(fā)生在關(guān)節(jié)軟骨，繼而影響軟骨下骨、滑膜、關(guān)節(jié)囊等最終導(dǎo)致整個(gè)關(guān)節(jié)受累。軟骨細(xì)胞是健康軟骨中存在的唯一細(xì)胞類型，因此，軟骨細(xì)胞的任何變異都會(huì)影響OA的進(jìn)展。Col II是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的一種多肽，是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，關(guān)節(jié)軟骨中Col II的纖網(wǎng)受損是軟骨退變的關(guān)鍵事件。在OA的發(fā)展過(guò)程中，OA軟骨細(xì)胞產(chǎn)生多種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），調(diào)節(jié)OA中ECM的降解和破壞等多種功能。其中，MMP-13是與軟骨分解代謝相關(guān)的最重要的金屬蛋白酶，具有分解Col II和蛋白多糖的作用。因此，MMP-13似乎是最重要的候選治療靶點(diǎn)之一。我們的研究結(jié)果表明，6周的游泳運(yùn)動(dòng)可明顯下調(diào)KOA小鼠軟骨中MMP-13蛋白及mRNA表達(dá)，同時(shí)Col IImRNA及蛋白表達(dá)顯著提升。提示，游泳可通過(guò)降低MMP-13表達(dá)、提高Col II含量從而抑制軟骨降解發(fā)揮保護(hù)軟骨的作用。

3.2游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨組織中NF-κB激活的影響

現(xiàn)有的研究尚未完全闡明OA的發(fā)病機(jī)制，但可以肯定的是，炎癥和炎性細(xì)胞因子在OA的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的關(guān)鍵，而抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生能夠延緩OA的進(jìn)展。研究表明，iNOS和COX-2是常見的炎癥介質(zhì)，參與骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程。iNOS可催化產(chǎn)生NO，而NO可促進(jìn)MMP的產(chǎn)生和激活，抑制Col II和蛋白多糖的合成，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解。COX-2可介導(dǎo)炎癥介質(zhì)PGE2的產(chǎn)生，PGE2可有效激發(fā)軟骨中的MMPs和ADAMTS-5表達(dá)，導(dǎo)致軟骨的退化。炎癥因子TNF-α和IL-6也被認(rèn)為是OA發(fā)生的重要因素，它們可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞，合成促炎性因子，從而導(dǎo)致OA的炎性反應(yīng)。Mohammed等研究發(fā)現(xiàn)，12周游泳可降低骨關(guān)節(jié)炎患者血清中IL-6的表達(dá)，但其調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎病理組織炎癥反應(yīng)的作用還不清楚。本研究結(jié)果顯示，KOA模型組小鼠循環(huán)血中TNF-α和IL-6水平顯著升高，同時(shí)病變軟骨中COX-2、iNOS陽(yáng)性表達(dá)也顯著提高，而6周游泳運(yùn)動(dòng)可顯著抑制軟骨及循環(huán)血中炎癥因子的表達(dá)，初步表明游泳運(yùn)動(dòng)可減輕KOA小鼠骨關(guān)節(jié)炎病理組織及全身炎癥反應(yīng)。

研究已證實(shí)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，其中核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通路起著至關(guān)重要的作用。NF-κB家族是由一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的Rel蛋白家族組成，包括NF-κB（p50/105）、NF-κB2（p52/1000）、RelA（p65）、RelB、c-Rel等，這些亞單位的N-末端都含有一個(gè)Rel同源區(qū)，介導(dǎo)Rel家族同DNA間的結(jié)合和蛋白間的二聚化作用，參與NF-κB的活化，其中NF-κB1（p50）和RelA（p65）異源二聚體是NF-κB活化的最常見的形式。通常情況下，胞質(zhì)中的NF-κBp65二聚體與NF-κB抑制物α（inhibitor of NF-κBα，IκBα）結(jié)合，不具有活性。當(dāng)受到炎癥因子等刺激后，胞質(zhì)中與NF-κBp65二聚體結(jié)合的IκBα磷酸化并與二聚體脫離進(jìn)而被降解，NF-κBp65通過(guò)乙酰化或磷酸化被激活，導(dǎo)致活化的p65進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因如iNOS、COX-2、MMP-13的轉(zhuǎn)錄，加速OA的發(fā)展。因此，干擾NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向策略可能為OA治療提供新的潛在治療方案。目前，游泳能否通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而延緩OA進(jìn)程未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，KOA小鼠軟骨中磷酸化IκBα（p-IκBα），p65及其磷酸化產(chǎn)物p-p65表達(dá)水平均顯著升高，而6周游泳運(yùn)動(dòng)可以顯著抑制其磷酸化水平，從而抑制了IκBα降解和NF-κBp65的活化。提示，游泳運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路激活，減少相關(guān)炎癥因子COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低MMP-13的表達(dá)，促進(jìn)Col II合成以改善軟骨基質(zhì)的降解，減輕KOA軟骨退變。

4結(jié)論

軟骨退變是ACLT介導(dǎo)的KOA小鼠早期病理變化，軟骨基質(zhì)降解和NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和是軟骨退變的重要原因;游泳運(yùn)動(dòng)可降低KOA小鼠軟骨基質(zhì)降解，減輕軟骨退變，并調(diào)節(jié)軟骨中NF-κB信號(hào)通路，降低炎癥反應(yīng)。這些可能是游泳運(yùn)動(dòng)延緩骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程的分子機(jī)制。

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