奶牛安氏隱孢子蟲巢氏PCR檢測方法的建立及應用

張園園 ， 張百慧 ， 李 簡 , 劉書婷 ， 韓 瑩 ， 王燕春 ， 蔡亞南

(吉林農業大學動物醫學院 ， 吉林 長春 130118)

隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲感染引起的一類人獸共患的寄生蟲病[1-2]。隱孢子蟲病最常見的癥狀是腹瀉，豬、羊、牛為該病病原體的主要宿主，動物感染后會表現出食欲減退、發熱、腹瀉腹痛、厭食消瘦、嘔吐以及生長停滯等癥狀，最終導致生產性能下降甚至喪失，給畜牧業造成巨大經濟損失[3-4]。

安氏隱孢子蟲是引起奶牛胃腸道疾病的主要病原之一，患病奶牛常出現水樣腹瀉、脫水進而食欲減退、生產性能降低、產奶量下降，嚴重影響奶牛場的經濟效益。目前，奶牛安氏隱孢子蟲病尚無有效的疫苗和治療藥物。因此，建立快速、特異、敏感的奶牛安氏隱孢子蟲的檢測方法，明確奶牛場安氏隱孢子的流行特征尤為重要，可為安氏隱孢子蟲病的防控提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑ExTaq酶為TaKaRa公司產品；糞便基因組DNA提取試劑盒為康為試劑生物科技有限公司產品。

1.2 樣本 2018—2019年在河南、湖北和湖南的奶牛場共采集563份奶牛糞便，每份100 g，將其編號記錄放入保鮮盒中帶回實驗室，4 ℃冰箱內保存。

1.3 卵囊的檢測與收集 糞便先蒸餾水沉淀，后采用飽和蔗糖溶液漂浮法[5]，蘸取表面液膜，改良抗酸染色法染色鏡檢[6]。收集卵囊置于2.5%重鉻酸鉀溶液里保存，置于4 ℃冰箱備用。

1.4 DNA提取 按照試劑盒說明書提取卵囊的DNA，保存在-20 ℃冰箱備用。

1.5 引物設計與合成 在NCBI上的GenBank中下載安氏隱孢子蟲18S rRNA和囊壁蛋白(COWP)基因序列，通過DNAMAN進行比較獲得保守區，通過Prime 5.0在保守區設計巢氏PCR引物，見表1。

表1 安氏隱孢子蟲巢氏PCR引物序列Table 1 Cryptosporidium andersoni nested PCR primer sequences

1.6 巢式PCR方法的建立 通過控制單一要素的改變，分別對樣品和引物(0.5～2.0 μL)，退火溫度(50～70 ℃)等條件進行優化，以獲得最合適條件。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測巢氏PCR產物。

1.7 特異性、敏感性和重復性試驗

1.7.1 特異性試驗 分別以大腸埃希菌、牛艾美爾球蟲、弓形蟲、微小隱孢子蟲的基因組cDNA為模板，將安氏隱孢子蟲基因作為陽性模板進行PCR擴增。

1.7.2 敏感性試驗 把測定完成的標準安氏隱孢子蟲DNA濃度10倍倍比稀釋，以各濃度DNA作為模板，并參考Zhang等[7]的巢氏PCR方法，分3個組進行巢氏PCR擴增。

1.7.3 重復性試驗 隨機抽取獲得的3個陽性樣品用2種基因建立的2種PCR方法分別完成3次重復擴增，校驗重復性。

1.8 巢式PCR檢測 用建立的COWP基因巢氏PCR方法對18S rRNA基因巢氏PCR檢測出的陽性樣本進行檢測。

2 結果

2.1 巢式PCR反應的優化與建立 巢式PCR反應體系總體積為25 μL，2種基因的兩輪反應體系一致。反應體系：ddH2O 17.3 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物1 μL，Taq酶0.2 μL，樣品1 μL。18S rRNA基因第1輪反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。第2輪反應退火溫度為62 ℃。COWP基因的兩輪反應條件與18S rRNA基因一致，退火溫度為53 ℃。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，18S rRNA巢氏PCR和COWP巢氏PCR分別擴增出片段大小約為407 bp和430 bp的條帶，與目的條帶大小一致，如圖1所示。

圖1 巢式PCR擴增結果Fig.1 Nested PCR amplification resultsA:18S rRNA基因； B:COWP基因; M:DNA標準DL2 000； 1～4：樣品編號； 5：陰性對照A:18S rRNA gene； B:COWP gene; M：DNA Marker DL2 000； 1-4：Sample number； 5：Negative control

2.2 巢式PCR檢測

2.2.1 特異性試驗 凝膠電泳結果如圖2所示，18S rRNA基因組僅于407 bp位置存在單一條帶，COWP基因組同樣僅于430 bp位置存在單一條帶。大腸埃希菌、牛艾美爾球蟲、弓形蟲、微小隱孢子蟲以及陰性對照均未擴增出條帶。

圖2 巢式PCR特異性試驗Fig.2 Nested PCR specificity testA:18S rRNA基因； B:COWP基因; M:DNA標準DL2000； 1：安氏隱孢子蟲； 2：大腸埃希菌； 3：牛艾美爾球蟲； 4：弓形蟲； 5：微小隱孢子蟲； 6：陰性對照A:18S rRNA gene; B:COWP gene； M：DNA Marker DL2 000； 1：Cryptosporidium andersoni； 2：Escherichia coli； 3：Eimel coccidia bovis； 4：Toxoplasma； 5：Cryptosporidium parvum; 6:Negative control

2.2.2 敏感性試驗 凝膠電泳結果如圖3所示，18S rRNA基因組在24.3 ng/μL、2.43 ng/μL、243pg/μL和24.3pg/μL四個泳道均可看到目的條帶，其中24.3 ng/μL條帶最清晰，24.3pg/μL能隱約看到條帶;COWP基因組和參考的核糖體RNA小亞基(SSU rRNA)基因在24.3 ng/μL、2.43 ng/μL和243pg/μL三個泳道均可看到目的條帶，其中24.3 ng/μL條帶最清晰，243pg/μL能隱約看到條帶。

圖3 巢氏PCR敏感性試驗Fig.3 Nested PCR sensitivity testA:18S rRNA基因; B:COWP基因; C:SSU rRNA基因； M:DNA標準DL2 000； 1：24.3 ng/μL； 2：2.43 ng/μL； 3：243pg/μL； 4：24.3pg/μL； 5：2.43pg/μL； 6：243fg/μL； 7：陰性對照A:18S rRNA gene; B:COWP gene； C:SSU rRNA gene; M：DNA Marker DL2 000； 1：24.3 ng/μL； 2：2.43 ng/μL； 3：243pg/μL； 4：24.3pg/μL； 5：2.43pg/μL； 6：243fg/μL； 7：Negative control

2.2.3 重復性試驗 凝膠電泳結果如圖4所示，18S rRNA基因組均能擴增出約為407 bp的目的條帶；COWP基因組均能擴增出約為430 bp的目的條帶。

圖4 巢式PCR重復性試驗Fig.4 Nested PCR repeatability testA:18S rRNA基因; B:COWP基因; M:DNA標準DL2 000； 1～3：1號陽性樣本； 4～6:2號陽性樣本； 7～9:3號陽性樣本； 10：陰性對照A:18S rRNA gene; B:COWP gene; M：DNA marker DL2 000； 1-3：Positive sample number 1； 4-6:Positive sample number 2； 7-9:Positive sample number 3； 10：Negative control

2.3 COWP基因巢式PCR檢測18S rRNA基因陽性樣本 通過建立的18S rRNA基因巢氏PCR方法檢測采集的來自華中地區三省部分牛場的糞便樣本，總陽性率為32.86%(185/563)，其中河南、湖北和湖南的總隱孢子蟲感染率分別為33.54%(53/158)、28.96%(53/183)和37.50%(79/222)，安氏隱孢子蟲感染率為83.78%(155/185)，為華中地區隱孢子蟲的優勢蟲種(表2)。運用SPSS 16.0計算18S rRNA基因巢氏PCR檢測出的華中地區3個省份陽性率的差異率：P=0.000 1，差異極顯著，具有統計學意義。

通過建立的COWP基因巢氏PCR方法檢測18S rRNA基因巢氏PCR檢測出的185份陽性樣本，185份樣本中檢測為陽性的樣本數為148，總陽性率為80.00%，其中河南、湖北和湖南檢測出的感染率分別為81.13%、83.02%和77.22%，安氏隱孢子蟲感染率為91.89%(136/148)(表2)。運用SPSS 16.0計算COWP基因巢氏PCR檢測出的3個省份陽性率的差異率：P=0.000 1，差異極顯著，具有統計學意義。

表2 隱孢子蟲陽性率Table 2 Positive rate of Cryptosporidium [份(%)]

使用Zhang等[7]建立的巢氏PCR方法檢測本試驗的全部樣本，檢測出的陽性樣本數為153份，陽性率為27.17%。18S rRNA基因巢氏PCR檢測出安氏隱孢子蟲陽性率為27.53%，COWP基因巢氏PCR檢測出安氏隱孢子蟲陽性率為24.16%，本試驗建立的2種方法中18S rRNA基因巢氏PCR檢測樣本陽性率最高。經SPSS 16.0計算分析本試驗建立2種巢式PCR檢測出的陽性率的差異率：P=0.001,差異極顯著，具有統計學意義。

應用18S rRNA基因巢氏PCR對華中地區三省奶牛場的563份奶牛糞便 DNA 樣品進行擴增，結果如圖5所示，9月份感染率最高，1月份感染率最低；春、夏、秋、冬4個季節安氏隱孢子蟲感染率分別為 20.14%、30.11%、36.71%和16.25%，秋季安氏隱孢子蟲感染率最高，4個季節感染率存在極顯著差異(P=0.006)，具有統計學意義。

圖5 隱孢子蟲感染情況Fig.5 C. andersoni infectionsA:不同月份感染情況； B:不同季節感染情況A:Infection in different months; B:Infection in different seasons

3 討論

隱孢子蟲病是一種重要的人獸共患寄生蟲病，常呈世界性分布，已經被世界衛生組織(WHO)列為人類最常見的6種腹瀉病之一。隱孢子蟲病目前尚無有效的疫苗和特效的治療藥物，所以早期的診斷對其防控顯得尤為重要。因此，本試驗建立一種敏感、特異的巢氏PCR檢測方法，可用于奶牛隱孢子蟲流行病學調查，為防控此病提供科學依據。

采用18S rRNA基因巢氏PCR檢測糞便樣本，檢測出4種隱孢子蟲，總陽性率為32.86%，其中微小隱孢子蟲陽性率為2.49%，牛隱孢子蟲陽性率為2.66%，安氏隱孢子蟲陽性率為27.53%，瑞氏隱孢子蟲陽性率為0.18%，安氏隱孢子蟲陽性率占4種隱孢子蟲總陽性率的83.78%。因此，確定安氏隱孢子蟲為華中地區的優勢蟲種。華中三省安氏隱孢子蟲感染率為27.53%，與經典巢氏PCR檢測的陽性率27.17%相比差異不顯著。其中河南、湖北和湖南安氏隱孢子蟲感染率分別為27.85%、20.22%和33.33%。

本次調查采樣中秋季感染率最高，冬季感染率最低，春夏兩季安氏隱孢子蟲的感染率差異不顯著(P>0.05)，不具有統計學意義；秋季安氏隱孢子蟲感染率存在極顯著差異(P=0.006)，具有統計學意義。在本次調查中安氏隱孢子蟲在9月份感染率最高，1月份感染率最低，這與Marzieh等[8]對愛爾蘭采樣調查的結果大致相同，這可能與飼養環境有關，夏季和秋季因氣候炎熱潮濕，圈舍養殖為安氏隱孢子蟲的傳播造就了有利的條件，冬季由于天氣干燥寒冷，不利于安氏隱孢子蟲的傳播，因此夏季和秋季的安氏隱孢子蟲感染率較高。但由于養殖環境變化，還不確定是否夏秋兩季感染率最高，需要進一步采樣檢測加以驗證。

目前，分子生物學技術是檢測隱孢子蟲較為有效的辦法[9]，本試驗建立的安氏隱孢子蟲巢氏PCR檢測方法不僅可以增加PCR反應的特異性，同時還能夠讓反應更加敏感，重復性較好，能夠用于臨床樣本的檢測。且本試驗建立的18S rRNA基因巢氏PCR的敏感性是COWP基因的10倍，18S rRNA基因巢氏PCR檢測更加敏感。