長鏈非編碼RNA-ATB對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響及其機制研究

高蜜陽，張榮明，熊亮，申錦帆，劉暢

（錦州醫科大學附屬第一醫院 燒傷整形科，遼寧 錦州121000）

瘢痕疙瘩是由于傷口、創傷、燒傷、手術切口或疾病等導致瘢痕形成，主要與成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質的大量沉積有關[1]。瘢痕疙瘩的臨床表現主要是高出皮膚的瘢痕組織生長，通常伴有瘙癢和疼痛。有研究顯示瘢痕疙瘩的形成與基因調控、炎癥因子、細胞因子和免疫因素等密切相關[2]。由于瘢痕疙瘩的發病機制和調控機制尚不清楚，瘢痕疙瘩的治療仍未取得突破性進展。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是非編碼RNA的亞類，其長度超過200 nt，且具有比編碼RNA 更強的組織和細胞特異性。lncRNA 在不同的細胞、組織及其不同的發育階段中表達均不同，并參與各種疾病的發生、發展，同時在細胞分化、增殖、遷移、凋亡和代謝等過程中起著重要的調節作用[3]。有研究顯示大量lncRNAs 在瘢痕疙瘩中存在異常表達，其中lncRNA AC073257.2 能夠調控GLI2基因，參與成纖維細胞的生長、增殖；lncRNA HNF1A-AS1 能夠調控HNF1A基因，參與瘢痕疙瘩的形成[4]。有研究顯示被轉化生長因子b 激活的長鏈非編碼RNA（lncRNA-ATB）在腫瘤、外周血管疾病、動脈粥樣硬化、骨關節炎、免疫性等疾病中發揮著重要作用[5-7]。然而ATB 在瘢痕疙瘩中的作用及機制尚未完全闡明。因此本研究采用RT-PCR 檢測瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中ATB 的表達水平，并進一步深入探討ATB 調控miR-200c/DNA 甲基轉移酶DNMT3B 通路在瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡中的作用，證實ATB/miR-200c/DNMT3B 軸對瘢痕疙瘩形成的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本

選取2017年12月—2018年7月在錦州醫科大學附屬第一醫院燒傷整形科接受瘢痕疙瘩治療的30 例患者。其中，男性19 例，女性11 例；平均年齡（32.7±10.1）歲；在手術前均未接受藥物治療、放射治療、化學治療、激光治療等。排除腫瘤、免疫性疾病及嚴重的肝腎功能不全患者。術中切除瘢痕疙瘩和少量周圍正常皮膚組織，標本保存于液氮中用于進一步實驗。同時分為瘢痕疙瘩組和正常皮膚組，以及瘢痕疙瘩成纖維細胞細胞組與正常成纖維細胞組。患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

DMEM 細胞培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，CCK-8 試劑盒購自大連碧云天生物技術有限公司，磷酸鹽緩沖液和胰蛋白酶購自上海思吉生物制品有限公司， RNA 逆轉錄試劑盒和Lipofectamine 2000 購自日本TaKaRa 公司，Trizol Reagent 和SYBR Green 購自美國Promega 公司，miRNeasy Mini Kit 購自德國Qiagen 公司，TaqMan MicroRNA Assay 試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，兔抗人DNMT3B、周期素依賴性激酶6（CDK6）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和β-actin 抗體購自美國Abcam 公司，HRP 標記的羊抗兔IgG 購自美國CST 公司。sh-ATB、sh-DNMT3B、miR-NC、miR-200c mimics 和miR-200c inhibitors 由中國上海Genepharm 公司合成。通過PCR 擴增野生型（o/e-ATB） 或突變體（o/e-NC）ATB 片段，并亞克隆到pcDNA3.1 載體，pcDNA3.1載體購自美國Invitrogen 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與轉染人瘢痕疙瘩成纖維細胞購自中國科學院上海細胞庫，采用含10%胎牛血清的DMEM 細胞培養基在37℃、5%二氧化碳平衡濕度培養箱中培養。取對數生長期細胞進行實驗，采用Lipofectamine 2000 按試劑盒說明書轉染sh-ATB、 o/e-ATB、 miR-200c mimics、 miR-200c inhibitors 和sh-DNMT3B，轉染24 h 后用于進一步實驗。同時根據不同轉染方式分為：sh-NC 組、sh-ATB組、o/e-NC 組、o/e-ATB 組、miR-NC 組、miR-200c mimics 組、miR-200c inhibitors 組、共轉染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組、共轉染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 組、共轉染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組、共轉染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組。

1.3.2 qRT-PCR采用miRNeasy Mini Kit 提取miRNA，使用TaqMan MicroRNA Assay 試劑盒檢測miR-200c 的相對表達量，并使用Applied Biosystem 7500 進行qRT-PCR，U6 作為內參。采用Trizol 提取組織和細胞中總RNA，使用NanoDrop 1000 分光光度計測定RNA 的濃度，使用PrimeScriptTMqRT-PCR試劑盒從總RNA 合成第一鏈互補DNA，并使用SYBR Green PCR Master Mix 進行qRT-PCR，以βactin 作為內參，按2-ΔΔCt法進行相對表達量分析。

1.3.3 細胞增殖轉染后24 h 收集各組細胞，以2×104個密度接種到96 孔培養板中，各組細胞分別培養0 d、1 d、2 d 和3 d 后，加入10 μl 的CCK-8 溶液，在37℃下再孵育2 h，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度值。

1.3.4 細胞凋亡轉染后24 h 收集各組細胞，以2×105個密度接種到6 孔培養板中，以2×104個密度接種到96 孔培養板中，加入10 μl Annexin VFITC 和5μl 碘化丙啶染色液（0.25 mg/ml），輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.3.5 雙熒光素酶將野生型ATB（ATB-WT）、突變型ATB（ATB-MUT）、野生型DNMT3B（DNMT3B-WT）或突變型DNMT3B （DNMT3B-MUT）克隆到pmirGLO 質粒受體中，同時將miR-200c mimics 或miR-NC 導入293 細胞中，共培養48 h 后采用雙熒光素酶受體分析系統測量雙熒光素活性。

1.3.6 Western blotting轉染后24 h 收集各組細胞，常規提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，使用10% SDS-PAGE 凝膠分離等量（50 μg）蛋白質樣品，110 V 電泳，250 mA 電轉至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉37℃封閉2 h。分別加入DNMT3B、CDK6、Caspase-3 和β-actin 一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，10 min/次，二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，30 min/次，ECL顯影。并使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 作為內參，計算相對表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，比較用配對t檢驗、獨立樣本t檢驗或重復測量設計的方差分析，進一步的兩兩比較用Dunnett-t檢驗，相關性分析用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATB 在瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達

瘢痕疙瘩組與正常皮膚組ATB 相對表達量分別為（2.96±1.07）和（1.11±0.49），經t檢驗，差異有統計學意義（t=8.561，P=0.000），瘢痕疙瘩組較正常皮膚組高。瘢痕疙瘩成纖維細胞細胞組與正常成纖維細胞組ATB 相對表達量分別為（2.37±0.26）和（1.07±0.12），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.814，P=0.001），瘢痕疙瘩成纖維細胞細胞組較正常成纖維細胞組高。sh-NC 組與sh-ATB 組ATB 的相對表達量分別為（0.44±0.10）和（1.01±0.15），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.476，P=0.005），sh-ATB 組 較sh-NC 組 高。o/e-NC 組與o/e-ATB 組ATB 的相對表達量分別為（1.01±0.06）和（1.97±0.21），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.686，P=0.002），o/e-ATB 組較o/e-NC 組高。

2.2 低表達ATB對成纖維細胞細胞增殖和凋亡的影響

sh-ATB 組與sh-NC 組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450 值比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD450 值比較有差異（F=180.102，P=0.000）；②sh-ATB 組與sh-NC 組的OD450 值比較有差異（F=61.130，P=0.000），sh-ATB 組較sh-NC組低；③sh-ATB組與sh-NC組的OD450 值變化趨勢比較有差異（F=10.612，P=0.000）。同時sh-NC 組與sh-ATB 組CDK6 的相對表達量分別為（0.96±0.12）和（0.57±0.08），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.678，P=0.010），sh-ATB 組較sh-NC 組低（見圖1）。進一步檢測細胞凋亡情況，sh-NC 組與sh-ATB 組細胞的凋亡率分別為（6.97±1.43）%和（14.00±1.37）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=6.142，P=0.004），sh-ATB組較sh-NC 組高（見圖2）。sh-NC 組與sh-ATB 組Caspase-3 的相對表達量分別為（0.99±0.12） 和（1.74±0.10），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.839，P=0.004），sh-ATB組較sh-NC組高（見圖3）。見表1。

圖1 sh-NC組與sh-ATB組CDK6相對表達量比較

圖2 低表達ATB對成纖維細胞凋亡的影響

圖3 低表達ATB對凋亡相關分子Caspase-3表達的影響

表1 sh-ATB組與sh-NC組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450值比較 （x±s）

2.3 ATB靶向結合miR-200c

miR-NC 組ATB-WT 和ATB-MUT 雙熒光素酶活性分別為（1.15±0.08） 和（1.07±0.09），miR-200c mimics 組分別為（0.47±0.04） 和（1.10±0.04）。兩組ATB-WT 雙熒光素酶活性比較，差異有統計學意義（t=13.083，P=0.000），兩組ATB-MUT雙熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（t=0.469，P=0.664）。o/e-ATB 組miR-200c 相對表達量為（0.45±0.06），o/e-NC 組為（1.02±0.12），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.190，P=0.002），o/e-ATB 組低于o/e-NC 組。sh-NC 組與sh-ATB 組miR-200c 相對表達量分別為（0.97±0.12） 和（1.47±0.12），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.977，P=0.008），sh-ATB 組高于sh-NC 組。瘢痕疙瘩組與正常皮膚組miR-200c 相對表達量分別為（0.66±0.20）和（1.17±0.39），經t檢驗，差異有統計學意義（t=6.461，P=0.000），瘢痕疙瘩組低于正常皮膚組。經Spearman 相關分析，ATB 與miR-200c 在瘢痕疙瘩組織中的表達水平呈負相關（rs=-3.429，P=0.000）（見圖4）。miR-NC 組miR-200c 相對表達量為（1.01±0.13），miR-200c mimics 組相對表達 量為（1.54±0.10）， miR-200c inhibitors 組為（0.45±0.08），經方差分析，差異有統計學意義（F=76.010，P=0.000），成纖維細胞細胞轉染miR-200c mimics 后能夠促進miR-200c 的表達，轉染miR-200c inhibitors 后能夠抑制miR-200c 的表達。

圖4 ATB與miR-200c在瘢痕疙瘩組織中表達的相關性

2.4 過表達miR-200c 對成纖維細胞細胞增殖和凋亡的影響

miR-200c mimics 組和miR-NC 組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450 值比較，經重復測量設計的方差分析顯示：①不同時間點間的OD450 值比較有差異（F=331.764，P=0.000）；②兩組的OD450值比較有差異（F=155.169，P=0.000），miR-200c mimics 組較miR-NC 組低；③兩組的OD450 值變化趨勢比較有差異（F=17.397，P=0.000）。miR-NC組與miR-200c mimics 組CDK6 的相對表達量分別為（1.00±0.16）和（0.45±0.07），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.529，P=0.005），miR-200c mimics組較miR-NC 組低（見圖5）。miR-NC 組與miR-200c mimics 組細胞凋亡率分別為（7.40±0.28）%和（16.53±1.14）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=9.252，P=0.001）（見圖6），miR-200c mimics 組較miR-NC 組高。miR-NC 組 與miR-200c mimics 組Caspase-3 的相對表達量分別為（1.02±0.22） 和（1.63±0.09），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.467，P=0.011）（見圖7），miR-200c mimics 組較miR-NC 組高。見表2。

圖5 過表達miR-200c對增殖相關分子CDK6表達的影響

圖6 過表達miR-200c對成纖維細胞凋亡的影響

圖7 過表達miR-200c對凋亡相關分子Caspase-3表達的影響

表2 miR-200c mimics組和miR-NC組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450值比較 （±s）

表2 miR-200c mimics組和miR-NC組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450值比較 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c mimics組0.56±0.03 0.56±0.01 1.16±0.07 0.65±0.10 1.71±0.10 1.15±0.12 2.22±0.17 1.64±0.14

2.5 miR-200c能夠靶向結合DNMT3B

miR-200c mimics 組DNMT3B-WT 和DNMT3BMUT 熒光素酶活性分別為（0.58±0.04） 和（0.97±0.08），miR-NC 組分別為（0.98±0.07） 和（1.04±0.07）。兩組DNMT3B-WT 熒光素酶活性比較，差異有統計學意義（t=8.094，P=0.001），轉染miR-200c mimics 后雙熒光素活性下降。兩組DNMT3B-MUT 熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（t=1.090，P=0.337）。miR-NC 組與miR-200c mimics 組DNMT3B 蛋白相對表達量分別為（1.02±0.05）和（0.51±0.04），經t檢驗，差異有統計學意義（t=13.796，P=0.000），miR-200c mimics 組較miR-NC 組低（見圖8）。miR-NC 組 與miR-200c inhibitors 組DNMT3B 蛋白相對表達量分別為（1.04±0.07）和（1.47±0.11），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.712，P=0.005），miR-200c inhibitors 組 較miRNC 組高。瘢痕疙瘩組與正常皮膚組DNMT3B 相對表達量分別為（2.28±0.70）和（1.03±0.30），經t檢驗，差異有統計學意義（t=9.025，P=0.000），瘢痕疙瘩組較正常皮膚組高。經Spearman 分析，miR-200c與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達水平呈負相關（rs=-2.011，P=0.001）（見圖9），ATB 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達水平呈正相關（rs=0.829，P=0.002）（見圖10）。

圖8 瘢痕疙瘩成纖維細胞轉染染miR-NC、miR-200c mimics和miR-200c inhibitors后DNMT3B的表達水平

圖9 miR-200c與DNMT3B在瘢痕疙瘩組織中表達的相關性

圖10 ATB與DNMT3B在瘢痕疙瘩組織中表達的相關性

2.6 ATB 調控miR-200c/DNMT3B 通路參與成纖維細胞細胞的增殖和凋亡

共轉染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組與sh-NC組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450 值比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD450 值比較有差異（F=192.560，P=0.000）；②兩組OD450 值比較無差異（F=4.339，P=0.054）；③兩組OD450 值變化趨勢比較無差異（F=1.024，P=0.409）。共轉染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組與sh-ATB 組成纖維細胞OD450 值比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD450 值比較有差異（F=138.352，P=0.000）；②兩組OD450值比較有差異（F=27.567，P=0.000）；③兩組OD450 值變化趨勢比較有差異（F=4.235，P=0.022）。sh-NC 組與共轉染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組細胞凋亡率分別為（6.97±1.43）%和（7.60±1.35）%，經t檢驗，差異無統計學意義（t=0.559，P=0.606）。見表3。

共轉染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 組與o/e-ATB 組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450 值比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD450 值比較有差異（F=271.965，P=0.000）；②兩組OD450 值比較有差異（F=42.868，P=0.000）；③兩組OD450 值變化趨勢比較有差異（F=7.459，P=0.002）。共轉染o/e-ATB 和miR-200c inhibitors 組和o/e-ATB 組細胞凋亡率分別為（2.37±0.85）%和（4.35±0.60）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.302，P=0.030），o/e-ATB 組較共轉染o/e-ATB+miR-200c inhibitors組高。見表4。

共轉染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組與miR-NC 組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450值比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD450 值比較有差異（F=177.080，P=0.000）；②兩組OD450 值比較無差異（F=0.002，P=0.964）；③兩組OD450 值變化趨勢比較無差異（F=2.661，P=0.083）。共轉染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組與miR-200c inhibitors 組成纖維細胞OD450 值比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD450 值比較有差異（F=171.475，P=0.000）；②兩組OD450 值比較有差異（F=45.448，P=0.000）；③兩組OD450 值變化趨勢比較有差異（F=6.883，P=0.003）。miR-NC 組與共轉染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組細胞凋亡率分別為（7.40±1.28）%和（6.63±0.91）%，經t檢驗，差異無統計學意義（t=0.848，P=0.444）。見表5。

共轉染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組與miR-200c mimics 組轉染后不同時間點的成纖維細胞OD450 值比較，經重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點間的OD450 值比較有差異（F=83.287，P=0.000）；②兩組OD450 值比較有差異（F=14.702，P=0.002）；③兩組OD450 值變化趨勢比較有差異（F=5.401，P=0.009）。共轉染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組 與miR-200c mimics 組 細胞 凋 亡 率分別為（21.17±1.41）% 和（16.53±1.14）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.440，P=0.011），共轉染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組較miR-200c mimics 組高。這提示ATB 能夠通過調控miR-200c/DNMT3B 通路參與成纖維細胞的增殖和凋亡。見表6。

表3 共轉染sh-ATB和miR-200c inhibitors對成纖維細胞細胞增殖的影響 （±s）

表3 共轉染sh-ATB和miR-200c inhibitors對成纖維細胞細胞增殖的影響 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d sh-NC組sh-ATB組共轉染sh-ATB+miR-200c inhibitors組0.57±0.05 0.57±0.02 0.59±0.03 0.93±0.15 0.73±0.13 0.88±0.06 1.63±0.13 1.15±0.15 1.45±0.13 2.06±0.17 1.48±0.13 1.90±0.09

表4 共轉染o/e-ATB和miR-200c inhibitors對成纖維細胞細胞增殖的影響 （±s）

表4 共轉染o/e-ATB和miR-200c inhibitors對成纖維細胞細胞增殖的影響 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d o/e-NC組o/e-ATB組共轉染o/e-ATB+miR-200c inhibitors組0.58±0.04 0.56±0.03 0.57±0.03 0.98±0.18 1.29±0.19 1.65±0.16 1.58±0.10 2.06±0.17 2.45±0.16 1.97±0.10 2.44±0.17 3.25±0.16

表5 共轉染miR-200c inhibitors和sh-DNMT3B對成纖維細胞細胞增殖的影響 （±s）

表5 共轉染miR-200c inhibitors和sh-DNMT3B對成纖維細胞細胞增殖的影響 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c inhibitors組共轉染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B組0.56±0.03 0.58±0.01 0.57±0.02 1.11±0.14 1.62±0.14 1.20±0.14 1.71±0.10 2.31±0.17 1.46±0.13 2.22±0.17 2.87±0.27 2.38±0.22

表6 共轉染miR-200c mimics和sh-DNMT3B對成纖維細胞細胞增殖的影響 （±s）

表6 共轉染miR-200c mimics和sh-DNMT3B對成纖維細胞細胞增殖的影響 （±s）

組別0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC組miR-200c mimics組共轉染miR-200c mimics+sh-DNMT3B組0.57±0.03 0.56±0.01 0.57±0.02 1.16±0.07 0.65±0.10 0.64±0.13 1.71±0.10 1.15±0.13 0.89±0.09 2.22±0.17 1.64±0.14 1.23±0.14

3 討論

在瘢痕疙瘩的研究中，越來越多的研究開始轉向LncRNAs 和miRNAs 對瘢痕疙瘩的調控作用[8]。目前采用基因芯片證實在瘢痕疙瘩存在大量異常表達的LncRNAs 和miRNAs，其中有研究顯示在瘢痕疙瘩中有1 731 種lncRNAs 表達上調，782 種lncRNAs 表達下調[9]。LncRNAs 能夠通過多種途徑參與疾病的調控，其中最常見的是ceRNA 機制，即LncRNAs 靶向結合miRNAs，進而調控下游分子的表達。miRNAs 是一類非編碼的小RNA，長度只有20～24 nt，在生物體基因組中普遍存在。目前研究證實miRNAs 只占所有RNA 的1.0%左右，但能夠調控機體30%～50%基因表達[10]。miRNAs 通過靶向調控靶mRNA，參與細胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡等多種細胞生物學行為。隨著對miRNAs 研究的深入，越來越多的證據表明miRNAs參與瘢痕疙瘩的形成[11]。然而關于LncRNAs 調控miRNAs 在瘢痕疙瘩中的研究尚少。

在本研究中采用qRT-PCR 檢測瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細胞中ATB 相對表達量，結果顯示ATB 在瘢痕疙瘩組織中的表達水平明顯高于正常皮膚，同時在瘢痕疙瘩成纖維細胞細胞中ATB的表達水平明顯高于正常成纖維細胞。這提示ATB在瘢痕疙瘩中存在明顯異常表達。在進一步的研究中采用shRNA 干擾技術在成纖維細胞中低表達ATB，結果顯示低表達ATB 能夠明顯抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡，同時下調增殖相關分子CDK6，上調凋亡相關分子Caspase-3 的表達水平。這提示ATB 參與瘢痕疙瘩的形成。然而其作用機制有待進一步探討。

有研究顯示miR-152-3p、miR-21、miR-200c和miR-203 在瘢痕疙瘩中均存在異常表達，并參與瘢痕疙瘩的形成[12-14]。同時研究顯示LncRNA HOXA11-AS 能夠靶向結合miR-124-3p 而抑制Smad5 的表達，參與瘢痕疙瘩細胞外基質的形成[15]。最近有研究顯示，ATB 能夠通過調控miR-200c 參與結直腸癌的發生發展[16]。在本研究中，雙熒光素酶結果顯示ATB 能夠靶向結合miR-200c，同時在成纖維細胞細胞中轉染o/e-ATB 后能夠明顯抑制miR-200c 的表達水平，在轉染sh-ATB 后能夠明顯促進miR-200c 的表達水平，這說明在成纖維細胞中ATB 能夠靶向抑制miR-200c。在進一步的人體瘢痕疙瘩組織中也正證實ATB 與miR-200c 的表達水平呈負相關。

為證實miR-200c 在成纖維細胞中發揮的作用，采用miR-200c mimics 過表達miR-200c 后能夠明顯抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡，同時下調增殖相關分子CDK6 和上調凋亡相關分子Caspase-3 的表達水平。這一結果與低表達ATB 對成纖維細胞的作用相似，更進一步提示ATB 能夠靶向結合miR-200c 而抑制miR-200c 的表達水平。

DNA 甲基化是表觀遺傳學中一種重要的修飾方式，主要是通過DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase, DNMT）來催化和維持起作用[17]。DNMT家族成員在生命的各種活動中均發揮重要作用，包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A 和DNMT3B，后兩者主要在哺乳動物中發揮作用[18]。DNMT3B 是從頭DNA 甲基化轉移酶，可以不需要甲基化的DNA 作模板，即可完成非甲基化的DNA 的甲基化修飾，研究顯示DNMT3B 參與了腫瘤、血管性疾病和免疫性疾病等[19]。同時也有研究顯示DNMT3B 在瘢痕組織中的表達水平明顯升高[20]。在本研究中雙熒光素酶結果顯示miR-200c 能夠靶向結合DNMT3B，同時在成纖維細胞細胞中轉染miR-200c mimics 后能夠明顯抑制DNMT3B 蛋白的表達水平，在轉染miR-200c inhibitors 后能夠明顯促進DNMT3B 蛋白的表達。 這進一步提示miR-200c 能夠靶向結合DNMT3B，進而抑制DNMT3B 的表達。同時miR-200c 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達水平呈負相關，ATB 與DNMT3B 在瘢痕疙瘩組織中的表達水平呈正相關，這提示ATB 可能通過靶向抑制miR-200c，進而促進DNMT3B 的表達，最后參與成纖維細胞細胞增殖和凋亡。

在進一步的回復驗證試驗中，已證實lncRNAATB/miR-200c/DNMT3B 軸在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的作用。結果顯示在瘢痕疙瘩成纖維細胞中共轉染sh-ATB 和miR-200c inhibitors 能夠逆轉單獨轉染sh-ATB 對細胞增殖和凋亡的影響，共轉染o/e-ATB和miR-200c inhibitors 能夠進一步加強單獨轉染o/e-ATB 對細胞增殖和凋亡的影響；瘢痕疙瘩成纖維細胞中共轉染miR-200c inhibitors 和sh-DNMT3B 能夠逆轉單獨轉染miR-200c inhibitors 對細胞增殖和凋亡的影響，共轉染miR-200c mimics 和sh-DNMT3B能夠進一步加強單獨轉染miR-200c mimics 對細胞增殖和凋亡的影響。這進一步證實ATB 能夠通過調控miR-200c/ DNMT3B 通路參與成纖維細胞增殖和凋亡。

綜上所述，ATB 在瘢痕疙瘩組織中高表達，低表達ATB 能夠通過調控miR-200c/DNMT3B 通路，抑制成纖維細胞增殖，并促進細胞凋亡。lncRNAATB/miR-200c/DNMT3B 軸在瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和凋亡中發揮著重要作用。ATB 可能成為瘢痕疙瘩治療的新靶點。