大孔樹脂對(duì)龍脷葉總黃酮的純化工藝及其吸附特性研究

陳素雯，邱思娃，蔡延渠，李苑新，吳燕紅

(廣東藥科大學(xué) 新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006)

龍脷葉(SauropiFolium)是嶺南地區(qū)常見的民族藥，性平，味甘、淡，歸肺、胃經(jīng)[1-3]，能平肝肺之火、利痰，以使?jié)峤登迳崛ヌ迪瑸槊袼尊B(yǎng)生所喜。廣東民間用龍脷葉治肺熱咳嗽已有50余年的歷史，驗(yàn)方記載：龍脷葉配伍紅菱根、牛大力和五爪龍，合為清燥潤(rùn)肺、理氣除痰之劑。近年來，黃酮類化合物在醫(yī)療和食品領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸廣泛。

大孔樹脂表面積較大，交換速度快,且熱穩(wěn)定性好，作為一種吸附性和篩選性原理相結(jié)合的分離材料，廣泛應(yīng)用于總黃酮的純化研究。本文旨在建立富集龍脷葉總黃酮的純化方法，闡明大孔樹脂的吸附特性，為進(jìn)一步開發(fā)利用龍脷葉總黃酮提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

龍脷葉(廣東時(shí)珍制藥有限公司，產(chǎn)地浙江，批號(hào)180801)；蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院，ID：A7KT-934V，含量92.6%)；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、乙醇為分析純；大孔樹脂D101、AB-8、NKA9、HPD100、HPD600、DM301，參數(shù)見表1。

表1 不同型號(hào)的大孔樹脂參數(shù)表Table 1 Parameters of macroporous resins of different models

UV1700分光光度計(jì)；ME204/02電子天平；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；TC-15套式恒溫器；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 龍脷葉總黃酮溶液的制備

稱取250 g龍脷葉，剪碎分批置于圓底燒瓶中，加入50倍量水,加熱,回流提取1.5 h。過濾，收集濾液。向?yàn)V渣中加入50倍量水,加熱,回流提取1 h。 過濾，合并濾液，濃縮至生藥濃度1 g/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大孔樹脂的預(yù)處理 稱取適量?jī)羝芳?jí)干樹脂，用95%乙醇浸泡，使樹脂充分溶脹。濕法裝柱，以95%乙醇洗脫，至洗脫液與水(1∶5)沒有渾濁。再用蒸餾水沖洗柱子，至無醇味，且流出液與蒸餾水混合不產(chǎn)生渾濁為止。

1.3.2 大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸 稱取大孔樹脂0.5 g，預(yù)處理后置于50 mL錐形瓶中，加入20.00 mL樣品溶液(生藥濃度0.1 g/mL)，室溫下，每隔5 min振搖10 s，持續(xù)120 min，靜置24 h，使其充分吸附。濾過，即得樹脂吸附后的溶液，測(cè)定吸附前后總黃酮濃度。

將吸附飽和的大孔樹脂用適量水洗去未被吸附的溶液和停留在樹脂表面的雜質(zhì)，濾干，加入20.00 mL 70%乙醇溶液，室溫下，每隔5 min振搖10 s，持續(xù)120 min，靜置24 h，使其充分解吸，過濾，收集解吸液，測(cè)定總黃酮的濃度。

按下列公式分別計(jì)算樹脂的飽和吸附量、吸附率、解吸量和解吸率。

Qe=(C0-CR)×V0/W

吸附率=[(C0-CR)/C0]×100%

Qd=(Cd×Vd)/W

D=(Qd/Qe)×100%

其中，Qe為樹脂飽和吸附量，C0、CR分別為吸附前、后吸附液中總黃酮的質(zhì)量濃度，V0、Vd分別為吸附液、解吸液的體積，W為干樹脂質(zhì)量，Qd為解吸量，Cd為解吸液濃度，D為解吸率。

1.4 總黃酮含量測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)[4-6]方法并進(jìn)行修正，以蘆丁為對(duì)照品，紫外分光光度法測(cè)定龍脷葉總黃酮含量。

精密稱取0.001 2 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加適量70%乙醇超聲溶解，冷卻后加70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得0.12 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加入500 μL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置6 min。加入500 μL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min。再加入4.0 mL 10%NaOH溶液，搖勻，放置30 min。用70%乙醇定容至刻度，搖勻。于最大吸收波長(zhǎng)505 nm 處測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=0.011X-0.007 7(R2=0.999 8),即在6～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

6種大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附及解吸附結(jié)果見表2。

由表2可知，HPD600靜態(tài)吸附率最高，但其解吸附性能較差；HPD100、DM301靜態(tài)吸附率與HPD600相近，且解吸率也較好；AB-8、D101雖然吸附率不高，但其解吸附性能好，解吸附量多。綜上，選擇HPD100、DM301、AB-8、D101進(jìn)一步考察其動(dòng)態(tài)吸附。

2.2 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解吸

分別稱取AB-8、D101、DM301、HPD100樹脂各5.0 g，處理后加入等量同濃度的樣品溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附、解吸，分別收集流出液、水洗液、洗脫液，測(cè)定吸光度，并計(jì)算各指標(biāo)，結(jié)果見表3。

比上柱量S=(M上-M流)/W

(1)

比吸附量A=(M上-M流-M水)/W

(2)

比洗脫量E=M洗/W

(3)

保留率R=(M洗/M上)×100%

(4)

純度P=M洗/W洗

(5)

式中M上——上樣溶液中待分離化學(xué)成分的含量，mg；

M流——流出液中待分離化學(xué)成分的含量，mg；

M水——水洗液中待分離化學(xué)成分的含量，mg；

M洗——洗脫液中待分離化學(xué)成分的含量，mg；

W洗——洗脫液出膏量，mg。

表3 4種大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附解吸結(jié)果Table 3 Dynamic adsorption and desorption results of four macroporous resins

由表3可知，4種型號(hào)吸附樹脂的比上柱量相近，差異不大，AB-8樹脂純化龍脷葉總黃酮的純度高于其他樹脂。故選擇AB-8型號(hào)的樹脂進(jìn)行純化工藝的優(yōu)化。

2.3 AB-8純化龍脷葉總黃酮工藝的優(yōu)化

取0.5 g AB-8大孔樹脂于50 mL的錐形瓶中，預(yù)處理后加入適量樣品溶液，進(jìn)行靜態(tài)吸附，解吸附后，通過計(jì)算總黃酮吸附量或解吸量，考察上樣溶液pH、上樣濃度、洗脫溶劑對(duì)大孔樹脂性能的影響。

取5.0 g AB-8大孔樹脂，預(yù)處理后濕法裝柱，將樣品溶液上柱，待充分吸附后，用適量蒸餾水沖洗樹脂柱，最后用乙醇溶液進(jìn)行洗脫，通過計(jì)算總黃酮吸附量或解吸量考察上樣流速、上樣量、水洗用量、洗脫用量、洗脫流速對(duì)大孔樹脂性能的影響，確定最適宜工藝參數(shù)[7-8]。

2.3.1 上樣溶液pH對(duì)靜態(tài)吸附的影響 結(jié)果見圖1。

圖1 上樣溶液pH對(duì)吸附效果的影響Fig.1 Effect of pH of sample solution on adsorption effect

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)龍脷葉在強(qiáng)酸條件下會(huì)有沉淀析出，而在堿性條件下,總黃酮的吸附率較低，可能是因?yàn)椴糠贮S酮類化合物含有酚羥基,呈弱酸性，在堿性條件下容易發(fā)生分解,而使結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，不利于與大孔樹脂形成氫鍵，因此，不容易被樹脂吸附。綜上所述，將龍脷葉提取液pH調(diào)至5進(jìn)行純化為宜。

2.3.2 上樣溶液濃度對(duì)靜態(tài)吸附的影響 由圖2可知，濃度過低，樹脂吸附不充分，吸附量少，不僅浪費(fèi)樹脂且純化效率低；濃度過高，則容易出現(xiàn)樹脂堵塞的現(xiàn)象，使大孔樹脂吸附受阻;另外，濃度過高的溶液上柱時(shí)，泄露也會(huì)提前，使處理量減少。因此，選擇料液比為0.167 mg/mL的提取液作為上樣溶液為宜。

圖2 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響Fig.2 Effect of sample concentration on adsorption effect

2.3.3 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 圖3表明,上樣流速在1 mL/min時(shí)，總黃酮吸附量達(dá)到最大，隨著流速的加快，吸附量明顯減少。可能是因?yàn)榱魉龠^快，使吸附質(zhì)來不及到達(dá)吸附位點(diǎn)就隨溶液流出，泄露嚴(yán)重。因此,選擇1 mL/min作為最佳上樣流速。

圖3 上樣流速對(duì)吸附效果的影響Fig.3 Effect of sample loading velocity on adsorption effect

2.3.4 泄露曲線 一般認(rèn)為，當(dāng)流出液中總黃酮濃度達(dá)到上樣溶液中總黃酮濃度的1/10時(shí)，即達(dá)到泄露點(diǎn)。由圖4可知，當(dāng)收集的流出液體積達(dá)到40 mL時(shí)，樹脂已出現(xiàn)明顯的泄露現(xiàn)象，為保證能夠充分利用樹脂并不浪費(fèi)樣品溶液，提高純化效率，選擇上樣液體積為1.5 BV。

圖4 泄漏曲線Fig.4 Leakage curve

2.3.5 水洗脫曲線 圖5顯示，當(dāng)水洗用量達(dá)到100 mL時(shí)，大部分未被吸附、停留在樹脂表面的總黃酮及其它雜質(zhì)已經(jīng)被洗脫下來，100 mL之后，再增加水洗用量作用不大。為節(jié)省時(shí)間,提高效率，選擇水洗用量為4 BV。

圖5 水洗脫曲線圖Fig.5 Water elution curve

2.3.6 洗脫溶劑對(duì)靜態(tài)解吸的影響 由圖6可知，低濃度和高濃度乙醇洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度較低，難以破壞樹脂與吸附質(zhì)之間的作用力，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，總黃酮解吸量最多，解吸效果最好。因此,選擇50%乙醇作為洗脫溶劑。

圖6 洗脫溶劑對(duì)解吸效果的影響Fig.6 Effect of elution solvent on desorption effect

2.3.7 溶劑洗脫曲線 圖7顯示，當(dāng)洗脫溶劑達(dá)到60 mL時(shí)，大部分總黃酮已被洗出；洗脫溶劑在60～100 mL時(shí)，仍含有部分總黃酮，100 mL之后，洗脫液中總黃酮含量極少。綜合考慮成本和時(shí)間，選擇洗脫溶劑用量為4 BV。

圖7 溶劑洗脫曲線圖Fig.7 Solvent elution curve

2.3.8 洗脫流速對(duì)動(dòng)態(tài)解吸的影響 圖8顯示，洗脫流速為2 mL/min時(shí)，總黃酮解吸量最多，解吸效率最高；流速過快時(shí)，洗脫劑與吸附位點(diǎn)的接觸時(shí)間短，縮短了相互作用的時(shí)間，不足以將總黃酮全部解吸。因此,選擇洗脫流速2 mL/min。

圖8 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響Fig.8 Effect of elution flow rate on desorption effect

2.3.9 工藝驗(yàn)證 分別稱取3份AB-8大孔樹脂各5.0 g，預(yù)處理后裝柱,按上述最優(yōu)條件進(jìn)行吸附和解吸附，測(cè)定流出液、水洗液、解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算各指標(biāo)參數(shù),結(jié)果見表4。

表4 龍脷葉總黃酮純化參數(shù)Table 4 Purification parameters of total flavonoids from Sauropi Folium

由表4可知，總黃酮純度從7.24%提高至22.17%，較純化前提高了3.06倍，RSD值為0.95%，表明AB-8純化龍脷葉總黃酮的工藝可靠穩(wěn)定，能達(dá)到富集總黃酮的純化效果。

2.4 樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)

稱取0.5 g AB-8大孔樹脂，進(jìn)行靜態(tài)吸附，在不同吸附時(shí)間下取樣，分別測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量。以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo),繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線，用準(zhǔn)一級(jí)、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和內(nèi)擴(kuò)散模型[7-10]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖9、表5。

圖9 吸附動(dòng)力學(xué)曲線(A)和顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型擬合曲線(B)Fig.9 Adsorption kinetics curve(a) and intra-particle diffusion model fitting curve(b)

表5 總黃酮吸附動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 Adsorption kinetics parameters of total flavonoids

由圖9(A)可知，在0～1 h內(nèi)，AB-8對(duì)總黃酮的吸附量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)大幅度增加；吸附1 h后，總黃酮吸附量增幅變緩，吸附率明顯降低。圖9(B)顯示,顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型擬合圖為三段式非線性圖，且直線不經(jīng)過原點(diǎn)，說明AB-8對(duì)龍脷葉總黃酮的吸附是一個(gè)連續(xù)性的分段過程，吸附過程由液膜擴(kuò)散和顆粒內(nèi)擴(kuò)散共同控制。表5顯示,龍脷葉總黃酮吸附行為更符合準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)，表明吸附過程受化學(xué)吸附機(jī)理的控制。

2.5 樹脂的吸附等溫線

分別稱取6份AB-8樹脂各0.5 g,于50 mL的錐形瓶中，預(yù)處理后分別加入20.00 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，進(jìn)行靜態(tài)吸附，測(cè)定吸附后吸附液的總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)，繪制等溫吸附線，采用Langmuir、Freundlich吸附等溫模型[9-12]進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖10、表6。

圖10 總黃酮吸附等溫線Fig.10 Adsorption isotherm of total flavonoids

表6 35 ℃下總黃酮吸附等溫線參數(shù)Table 6 Adsorption isotherm parameters of total flavonoids at 35 ℃

由圖10可知，同一溫度下,隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加，大孔樹脂吸附量增加。總黃酮吸附符合Freundlich模型，表明可能為單分子層吸附，但難以實(shí)現(xiàn)理想體系下的單分子吸附現(xiàn)象。在Freundlich模型中，n<1，說明總黃酮吸附為非優(yōu)惠吸附；ΔG=-8.66(kJ/mol)<0，說明總黃酮吸附過程是自發(fā)進(jìn)行的。

3 結(jié)論

AB-8型大孔吸附樹脂吸附龍脷葉總黃酮過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，由液膜擴(kuò)散和顆粒內(nèi)擴(kuò)散步驟共同控制。吸附行為符合Freundlich模型，可能為單分子層吸附和非優(yōu)惠吸附，吸附行為是自發(fā)進(jìn)行的。經(jīng)AB-8樹脂純化后，龍脷葉總黃酮純度為22.17%,提高了3.06倍，保留率98.42%，工藝有效可靠。