低氧脅迫對軍曹魚幼魚生長、血清生化和非特異性免疫指標的影響

王維政，曾澤乾，黃建盛,2,3*，郭志雄，李洪娟，陳剛,2,3

(1.廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524025；3.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088)

1 引言

魚類的生長受到內源和外源兩方面因素的調控，外源因素主要包括食物、水溫、溶解氧、鹽度、光照和pH 等，其中溶解氧對確保魚類的正常生長至關重要[1]。然而，由于自然和人為因素的干擾（水環境污染、藻華和高密度的水產養殖），魚類不可避免地會受到低氧的脅迫。在全球范圍內，水體低氧是海洋和淡水生態系統面臨的最緊迫和最普遍的問題之一，目前已經發現了大量“死區”是水生生物無法生存的[2]，這對水生生物造成了不同程度的影響。研究表明，水體的溶氧量與魚類的運動、攝食、代謝狀態和激素水平等有密切的聯系，水體的低氧不僅會造成魚類存活率下降和生長緩慢，還會影響魚體的免疫和生殖等機能，甚至造成魚類的死亡[3-4]。而且，全球氣候變化還可能會加劇水體低氧的問題[5]，導致養殖成本增加和商業利潤降低，嚴重制約水產養殖的發展[3]。因此，研究低氧對魚類的影響，不僅對探究魚類的低氧適應機制具有理論意義，還對指導水產養殖的實際生產具有參考價值。

軍曹魚(Rachycentron canadum)，隸屬于鱸形目，軍曹魚科，軍曹魚屬，又稱海鱺和海龍魚，是熱帶和亞熱帶海域的肉食性洄游經濟魚類，主要分布在太平洋、大西洋和印度洋等沿岸海域和港灣[6]。軍曹魚肉質鮮美，營養豐富，并且生長速度極快，其海水網箱養殖在我國南方地區發展迅猛，養殖潛力巨大，已成為近海浮動式網箱和深海網箱養殖的重要品種[7]。近年來，軍曹魚的養殖海區由于天氣、溫度等的影響，經常會出現缺氧的現象，黃建盛等[8]在前期已研究了急性低氧脅迫對軍曹魚幼魚血液生化指標的影響，血液生化指標可以作為魚類應激時體內物質代謝和組織器官機能狀態變化的一個重要指標，還能了解機體的氧化損傷[9]，對施氏鱘（Acipenser schrenckii）[10]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[11]、胡子鯰（Clarias batrachus）[12]和大西洋鮭（Salmo salar）[13]等魚類也報道過低氧脅迫對血液指標影響的相關研究，但目前還未開展長期低氧脅迫對軍曹魚血液指標影響的研究。因此，本文以軍曹魚幼魚為研究對象，對軍曹魚在長期低氧脅迫下不同時間的生長、血清糖脂代謝水平、肝功能、離子濃度和非特異性免疫等指標進行分析，旨在為軍曹魚的耐低氧新品種的選育提供基礎資料。

2 材料與方法

2.1 實驗用魚與飼養管理

軍曹魚幼魚由廣東海洋大學湛江東海島生物研究基地提供。實驗在廣東恒興飼料實業股份有限公司863 基地進行，養殖設施為室內24 h 持續充氣的流水養殖系統，水體500 L，挑選健康、有活力、規格均一、初始體質量為（50.44±2.78）g 的軍曹魚幼魚250尾，暫養1 周后進行實驗。暫養期間持續充氣，溶解氧濃度在6 mg/L 以上，自然光周期（12 h∶12 h），海水為砂濾海水，溫度為（29±1）℃，鹽度為28～30，pH 為7.8～8.0，氨氮含量小于0.02 mg/L，每天08:00 和16:00各飽食投喂配合飼料（廣東越群海洋生物研究開發有限公司）1 次，投喂1 h 后清理糞便和殘餌。

2.2 低氧脅迫實驗

暫養結束，把軍曹魚禁食24 h 后隨機分為低氧脅迫和常氧對照兩個處理組，每個處理組3 個重復，每個重復35 尾魚。低氧脅迫組的水體溶氧濃度設計為3 mg/L，3 mg/L 的溶氧濃度通過覆蓋薄膜和調整充氣量以及流水量的大小來實現。首先把每一個養殖水槽覆蓋上薄膜并且關掉流水以及停止充氣，利用軍曹魚的呼吸作用使水體溶解氧自然降低至接近3 mg/L，隨后通過大約3 h 的不斷調整流水量及充氣量的大小使水體溶氧穩定，穩定之后開始計時進行為期28 d 的低氧脅迫實驗，其他條件與暫養期間一致。常氧對照組所有養殖條件均與暫養時相同。實驗期間間隔1 h，使用化學滴定法(GB 7489?87)對水體溶氧進行測定，低氧脅迫組的溶氧濃度能夠穩定在（3.15±0.21）mg/L的水平，常氧對照組溶氧濃度為（6.18±0.24）mg/L。

2.3 血清樣品的制備及指標的測定

在低氧脅迫的第1 天、第7 天、第14 天、第28天，每次從各個水槽隨機取8 尾魚，使用MS-222 快速麻醉后進行稱重，隨后用1 mL 無菌注射器在尾鰭下方進行靜脈抽血，血液在室溫靜置1 h 后置于4℃冰箱過夜，3 500 r/min 離心15 min，吸取上層血清到2 mL凍存管，放入?80℃超低溫冰箱保存備用。

根據測得的體重分別計算低氧組和對照組在第1 天、第7 天、第14 天、第28 天的增重率（WGR）和特定生長率（SGR），計算公式為

式中，W1為實驗開始前的體重（g）；W2為各個時間點的體重（g）；t為脅迫的時間（d）；ln 為自然對數符號。

血清生化指標用深圳雷杜生命科學股份有限公司全自動生化分析儀（型號為Chemray 240）測定，所用試劑購自長春匯力生物技術有限公司。生化指標包括：總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、血糖（GLU）、鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）、鈣離子（Ca2+）、氯離子（Cl?）。其中ALT 和AST 指標采用速率法，其他生化指標采用終點法進行測定。

血清非特異性免疫指標均采用南京建成生物科技有限公司生產的試劑盒測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性用羥胺法測定，過氧化氫酶(CAT)活性用可見光法測定，丙二醛（MDA）含量采用TBA 法測定，溶菌酶(LZM)活性用比濁法測定。

2.4 數據分析

利用GraphPad Prism 5 軟件對數據進行處理及作圖，采用配對t檢驗方法分析低氧脅迫組與其對照組各指標數據差異顯著性，以p＜0.05 表示差異顯著，p＜0.01 表示差異極顯著。

3 結果

3.1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚生長的影響

由圖1 可知，在低氧脅迫過程中，軍曹魚幼魚的生長速度與對照組相比較為緩慢，低氧組軍曹魚增重率和特定生長率在第7 天與對照組具有顯著性差異（p＜0.05），在第14 天和第28 天則具有極顯著差異（p＜0.01）。

3.2 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清肝功能指標的影響

由圖2 可知，在低氧脅迫過程中，軍曹魚幼魚血清AST 和ALT 活性都呈不斷升高的趨勢，其中AST 活性在第7 天、第14 天和第28 天極顯著高于對照水平（p＜0.01），而ALT 活性則在第14 天和第28 天與對照組具有極顯著差異（p＜0.01）；TP 和ALB 含量的變化趨勢一致，均呈上升的趨勢，并且都在第14 天和第28 天顯著高于對照水平（p＜0.05）。

3.3 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清糖脂代謝水平的影響

圖1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚特定生長率（a）、增重率（b）的影響Fig.1 Effects of hypoxia on the specific growth rate (a) and weight gain rate (b) in the serum of juvenile cobia (Rachycentron canadum)

圖3 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清葡萄糖（a）、總膽固醇（b）和甘油三酯（c）含量的影響Fig.3 Effects of hypoxia on the contents of glucose (a),total cholesterol (b),and triglyceride (c) in the serum of juvenile cobia(Rachycentron canadum)

由圖3 可見，在低氧脅迫過程中，軍曹魚幼魚血清GLU 含量在第1 天顯著升高（p＜0.05）后在第7 天降低到對照水平，之后在第14 天極顯著升高（p＜0.01）后又呈下降的趨勢，但在第28 天仍然與對照組具有顯著性差異（p＜0.05）；TG 含量先保持對照水平后呈不斷上升的趨勢，在第14 天和第28 天極顯著高于對照水平（p＜0.01）；TC 含量在第1 天顯著下降（p＜0.05），隨后呈不斷上升的趨勢，并在第14 天和第28 天極顯著高于對照組（p＜0.01）。

3.4 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清離子濃度的影響

由圖4 可見，在低氧脅迫過程中，軍曹魚幼魚血清Na+和Cl?含量變化趨勢一致，在脅迫的第1 天和第7 天沒有顯著性變化，在第14 天和第28 天則極顯著高于對照組（p＜0.01）；K+含量不斷升高并在第7 天、第14 天和第28 天與對照組具有顯著性差異（p＜0.05）；Ca2+含量則呈不斷下降的變化趨勢，在第14 天和第28 天顯著低于對照水平（p＜0.05）。

3.5 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清非特異性免疫指標的影響

由圖5 可見，在低氧脅迫過程中，軍曹魚幼魚血清SOD 活性不斷上升，且在第7 天、第14 天和第28 天與對照組相比具有極顯著差異（p＜0.01）；CAT 活性在第1 天極顯著下降（p＜0.01），在第7 天又顯著升高（p＜0.05），之后呈不斷下降的趨勢，在第28 天極顯著低于對照組（p＜0.01）；MDA 含量總體呈不斷上升的趨勢，在第14 天和第28 天極顯著高于對照水平（p＜0.01）；LZM 活性在第1 天顯著上升（p＜0.05）后呈不斷下降的變化趨勢，并且在第28 天極顯著低于對照組（p＜0.01）。

4 討論

4.1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚生長的影響

溶解氧作為魚類養殖過程中最重要的環境因子之一，嚴重制約著魚類的生長。在飽和的溶解氧水平下，魚類新陳代謝旺盛，能夠有效地將蛋白質和脂質等營養素轉化為生長效能，使魚類快速生長，而在低氧狀態下，魚類則會表現為攝食量減少、飼料轉換率低下和生長緩慢，甚至還會出現死亡[14-16]。相關研究表明，在21 d 的低氧（3 mg/L）脅迫過程中，香魚（Plecoglossus altivelis）游動減少，攝食不夠積極，體重顯著低于對照組，甚至出現了負增長的現象[4]。在草魚（Ctenopharyngodon idella）[17]的研究中也發現，8 周的養殖過程中，草魚的生長受到低氧（3.5 mg/L）的顯著抑制。在本文的研究中也觀察到類似的現象，與對照組相比，軍曹魚幼魚在低氧環境中食欲下降，經常在水槽底部處于靜止狀態，生長速度顯著降低，增重率和特定生長率在低氧脅迫第7 天顯著低于對照組，在第14 天和第28 天則與對照水平具有極顯著的差異，由此推測軍曹魚幼魚可能在低氧脅迫過程中將蛋白質和脂質等營養素轉變為生長能的效率低下，低氧嚴重抑制了軍曹魚的生長。因此在軍曹魚的養殖過程中要避免長時間的低氧，以防對其生長發育造成影響。

圖4 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清鈉離子（a）、鉀離子（b）、氯離子（c）和鈣離子（d）含量的影響Fig.4 Effects of hypoxia on the contents of sodium ion (a),potassium ion (b),chloride ion (c) and calcium ion (d) in the serum of juvenile cobia (Rachycentron canadum)

圖5 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清超氧化物歧化酶（a）、過氧化氫酶（b）、溶菌酶（d）活性和丙二醛（c）含量的影響Fig.5 Effects of hypoxia on the activities of superoxide dismutase (a),catalase (b),lysozyme (d) and the contents of malondialdehyde (c)in the serum of juvenile cobia (Rachycentron canadum)

4.2 低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝功能的影響

肝臟作為魚體內最大的腺體器官，具有代謝、排泄、解毒和營養吸收等眾多生理功能，對肝功能指標的檢測能夠反映魚類生理功能的健康狀態[18]。AST和ALT 是動物體內重要的轉氨酶，作為評價肝細胞損傷或壞死的最可靠指標，在非必需氨基酸的合成以及蛋白質的分解代謝中起著重要的中介作用[19]。在正常的情況下，由于細胞膜的屏障作用，血清AST 和ALT 活性很低，但是當肝臟受損時，細胞膜的通透性升高，轉氨酶釋放到血清中的速度加快，導致血清轉氨酶活性升高[20]。在本研究中，與對照組相比，隨著低氧脅迫時間的延長，血清AST 和ALT 活性持續升高，說明低氧脅迫對軍曹魚幼魚的肝臟造成了損傷。值得注意的是，本研究中AST 和ALT 活性在低氧脅迫的第14 天和第28 天均極顯著高于對照組，說明軍曹魚幼魚可能在低氧脅迫的第14 天和第28 天，肝臟受損嚴重，影響魚體的氨基酸和蛋白質代謝。血清TP 主要在肝臟和網狀內皮系統的漿細胞內合成，由血清ALB 和血清球蛋白等組成，作為體內主要營養源，具有維持體內滲透壓和修補組織的功能，其含量的高低能夠反映機體生長發育情況以及生理健康狀態[21]。ALB 在維持血液滲透壓穩定過程中發揮重要作用，參與營養運輸、凝血、抗凝血、肝細胞修復及再生等過程，以保持體內一個穩定的化學環境[22]。本文的研究結果表明，軍曹魚幼魚血清TP 和ALB 含量在低氧脅迫后均呈現升高的趨勢，而且在低氧脅迫的第14 天和第28 天顯著高于對照組，原因可能是軍曹魚幼魚受到低氧的刺激以及肝臟受到一定程度的損傷，使機體的蛋白質代謝受到影響，導致血清TP 和ALB 含量上升[23?24]。而花鱸（Lateolabrax maculatus）幼魚在低氧脅迫后血清TP 和ALB 含量卻出現了顯著下降的現象[25]，軍曹魚大規格幼魚在低氧脅迫后血清TP 含量也顯著低于脅迫前[8]，原因可能是魚的種類、脅迫的嚴重程度和時間等的不同都會對血清蛋白的含量造成不同程度的影響。

4.3 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清糖脂代謝水平的影響

魚類的GLU 主要來源于食物的消化吸收、肝糖原的分解以及糖異生作用，其含量與魚體的運動、攝食、生物學特性和環境的變化有關，是機體能量的主要來源，在遭受環境脅迫后魚體發生應激，會導致GLU 含量升高[26]。本研究中，軍曹魚幼魚在低氧脅迫的第1 天、第14 天和第28 天，血清GLU 含量顯著高于對照組，可能是軍曹魚幼魚在經歷低氧后，肝糖原大量分解為機體提供能量，以滿足自身能量需求。該研究結果與羅非魚（Oreochromis niloticus）[1]和大口黑鱸（Micropterus salmoides）[3]的低氧實驗結果相類似。血清TG 和TC 含量能夠反映機體對脂類代謝的狀況，低氧脅迫1 d 后，軍曹魚幼魚TC 含量顯著下降，在花鱸的氧化應激實驗中[25]，花鱸血清中TG 和TC 含量在低氧12 h 后也顯著下降，與本研究結果類似，這可能也是魚類應對低氧的策略，加快脂類代謝，以滿足魚體在脅迫后對能量的需求。已有研究表明，魚類血清中70%～80%的TC 源于肝細胞，一旦肝細胞受損則血清TC 含量升高，并且肝損傷也會導致血清TG 含量增加[27]，血清TC 和TG 含量的升高也說明肝臟中脂肪堆積較多，脂質代謝出現紊亂[28]。本研究中，隨著脅迫時間的延長，軍曹魚幼魚血清TC 和TG 含量在低氧脅迫的第14 天和第28 天顯著高于其對照組，推測長時間的低氧脅迫使軍曹魚幼魚的脂質代謝出現異常。結合前文肝功能指標推測，肝臟組織的損傷很可能是導致軍曹魚幼魚代謝異常的原因。另外，在低氧脅迫的第7 天，血清GLU、TG 和TC 含量均與對照組無顯著性差異，表明在低氧脅迫的7 d內，軍曹魚幼魚可能通過自身的調整，使機體代謝恢復到正常水平，但是更長時間的低氧脅迫則會導致代謝的失調，最終嚴重限制了軍曹魚的生長。

4.4 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清離子濃度的影響

當外界的環境脅迫開始對代謝活動產生影響的時候，魚體的調節機制就會試圖將組織損傷所引起的免疫反應造成的損傷降到最低，調節機制功能的發揮必須保持細胞的最佳pH 和滲透壓，這一般通過調節細胞內外離子的穩態來實現[11]。血清離子是維持細胞新陳代謝、酸堿平衡以及調整體液滲透壓的重要因子[29]。本文軍曹魚幼魚在低氧脅迫后Na+、Cl?、K+含量均呈現升高的趨勢，推測原因是水體中較低的溶解氧使魚體產生應激反應，為了使水中的氧氣更容易擴散到血液中，魚類可能通過改變鰓的形態，增大鰓的擴散容量，增加有效呼吸面積，使水體中的離子進入魚體，導致血清中離子含量增加[30]。而在通常情況下，魚類的鰓上皮對離子的通透性大小依次為H+、K+、Na+、Cl?、Ca2+[31]，所以過多的Na+、Cl?、K+進入血液，使其含量增多。這與區又君等[30]對卵形鯧鲹的研究結果相類似。硬骨魚的Na+含量與pH 相關，其含量的變化會改變魚類體液的酸堿度[32]，Cl?含量的變化大體上與Na+和K+一起進行[33]，而K+的失衡則會導致細胞膜破裂，還可能引起細胞的死亡[32]。本研究中，軍曹魚幼魚血清Na+和Cl?含量在脅迫的第14 天和第28 天顯著上升，K+含量在脅迫的第7 天開始出現顯著性升高，表明長時間的低氧脅迫對軍曹魚體幼魚體液內環境造成了影響。Ca2+含量在脅迫過程中呈現不斷下降的變化趨勢，并且在第14 天和第28 天具有顯著性差異，推測其原因可能是長時間的低氧脅迫導致軍曹魚機體代謝異常，肌肉的興奮性降低，從而導致Ca2+含量下降。

4.5 低氧脅迫對軍曹魚幼魚血清非特異性免疫因子的影響

氧化應激作為機體細胞水平上最常見的應激反映，是魚類應激生物學研究領域當中的一個重要分支。脂質過氧化產物MDA 和酶抗氧化系統SOD、CAT 常作為衡量氧化應激水平的指標，并且抗氧化酶對增強吞噬細胞防御能力和機體免疫功能方面有重要的作用[34?35]。SOD 是生物抗氧化酶類的重要成員，能夠將氧化應激過程中產生的超氧陰離子自由基（O2?）清除，將其轉化為H2O2和O2，保護細胞免受損傷，被認為是機體最重要的抗氧化酶之一[36]，而CAT則將SOD 產生的H2O2轉化為H2O，保護機體細胞內環境的穩定[35]。MDA 作為脂質過氧化產物，反映機體的氧化損傷程度[37]。本研究表明，軍曹魚幼魚在28 d 低氧脅迫過程中，血清MDA 含量和SOD 活性呈上升的趨勢，并在第14 天和第28 天顯著高于其對照組，說明隨著低氧脅迫時間的延長，軍曹魚幼魚機體氧化損傷程度持續加重。在低氧脅迫過程中產生的大量活性氧，不斷激活自身的抗氧化系統，導致SOD活性升高，以清除產生的活性氧。血清CAT 活性在低氧脅迫的第1 天顯著低于對照組，可能是在脅迫的第1 天，溶氧的變化導致產生的活性氧過多，抑制了CAT 的活性，而在脅迫的第7 天，隨著SOD 活性的不斷增強，產生的H2O2可能誘導CAT 活性顯著升高。而隨著低氧脅迫時間的延長，血清CAT 活性呈現下降的趨勢，并在第28 天顯著低于對照水平。結合MDA、AST 以及ALT 指標，表明，隨著低氧應激的程度加劇，軍曹魚幼魚機體受到一定程度的氧化損傷，抗氧化物質合成能力下降，氧化?抗氧化失衡[38]，導致CAT的活性顯著下降。另外，有研究認為，氧化應激產生的活性氧和過氧化物激活NF-KB 和NF-KB 介導的炎癥通路[39]，誘導多種炎癥因子的產生，而這些因子反過來又會刺激NF-KB 介導的炎癥通路，使得炎癥反應呈現級聯發達效應，從而導致嚴重的肝臟損傷，但具體的反應機制還需要進一步的研究證明。

LZM 是魚類血液中非特異性免疫因子之一，是吞噬細胞殺滅吞噬病原菌的基礎，能夠水解細菌細胞壁中的乙酰氨基多糖，從而破壞和消除侵入體內的異物，其活性的高低能夠反映溶菌活性的強弱，擔負著機體的防御功能，能夠反映機體的免疫狀態[40?41]。Wang等[42]在研究中發現，魚類在環境中溶氧下降之后會通過迅速改變機體的生化指標來提高免疫力，這是一種適應環境壓力的調節機制。本文中軍曹魚幼魚在低氧脅迫的第1 天，血清LZM 活性也顯著升高，說明軍曹魚幼魚通過調節機體的LZM 活性，提高自身的免疫力，以適應低氧的環境。這與武昌魚（Megalobrama amblycephala）在低氧脅迫后LZM 活性上升的現象一致[43]。但是低氧脅迫的第7 天，LZM 的活力不斷下降，并且在第14 天和第28 天顯著低于對照組。劉淑蘭和翟少偉[38]的研究表明，應激的時間持續延長時，過度分泌的激素會抑制機體的免疫能力，免疫因子和免疫細胞活性降低，表明長時間的低氧，不僅造成組織損傷，影響機體的代謝水平，還可能會對免疫系統造成影響，致使免疫力下降。

綜上，低氧脅迫對軍曹魚幼魚造成一定程度的氧化損傷，抑制其生長并使血清生化和非特異性免疫相關指標發生顯著變化，表明軍曹魚機體物質代謝和免疫系統受到影響。因此在軍曹魚的養殖過程中要避免長時間的低氧脅迫，保持水體溶氧充足。