Beclin1及miRNA-130a與HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者預(yù)后的相關(guān)性

陳崇高 符厚萱 王小智 謝會忠

據(jù)調(diào)查，國內(nèi)屬HBV感染流行地區(qū)，其中HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患病率占所有急性肝衰竭的70%以上，由于其病情危重，救治困難，導(dǎo)致死亡率達60%～80%[1-2]。目前該病病理生理機制尚未闡明，有研究顯示，自噬參與肝病(如肝癌等)病理過程[3-4]。尤其是關(guān)于血清Beclin1表達，其雖可反映機體自噬狀況，但在HBV-ACLF發(fā)病機制中的作用尚未明確。另有報道認為，血清miRNA與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，尤其是血清miRNA-130a表達，其在癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移過程中意義重大，但現(xiàn)階段關(guān)于其與HBV-ACLF患者預(yù)后的關(guān)系仍有待證實[5]。

資料與方法

一、一般資料

選擇HBV-ACLF患者132例，納入時間為2016年8月至2019年8月，已通過醫(yī)院倫理委員會審核。HBV-ACLF診斷參考相關(guān)標準[6]，慢性肝病前提下4周內(nèi)有消化道癥狀、失代償腹水、乏力、黃疸出現(xiàn)；不伴或伴肝性腦病；INR為1.50及以上或PTA為40.00%及以下(其他凝血異常原因排除)。排除丙或丁型肝炎及其他肝病；排除各種惡性腫瘤和急慢性感染、腎功能不全及其他病因所致免疫復(fù)合物腎炎。根據(jù)入院治療6個月生存情況，將患者分為死亡組(67例)和生存組(65例)，并選取同期入院的62例健康體檢者為正常對照組。三組基線資料無顯著差異(P>0.05)。

二、研究方法

(一)血清Beclin1檢測 清晨空腹采集血清標本，酶聯(lián)免疫吸附分析法測定Beclin1(上海江萊生物科技有限公司)。

(二)血清miRNA-130a檢測 血清總RNA提取參考mirVana miRNA分離試劑盒(美國Ambion公司)進行，后行RNA純度測量。參考GenBank數(shù)據(jù)明確待測基因序列，設(shè)計引物(表1)，行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：93 ℃ 5 min，93 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)40個，行PCR擴增，采集熒光，檢測血清miRNA-130a表達量。PCR基因擴增儀2720購自美國ABI公司，RT-PCR試劑盒購自美國Thermo公司，miRNA-130a、β-actin引物序列均購自美國Abmart公司。

表1 PCR引物設(shè)計

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、 比較兩組患者血清Beclin1及miRNA-130a表達情況

對于血清Beclin1，死亡組較生存組及正常對照組明顯升高(P<0.05)，生存組較正常對照組明顯升高(P<0.05)；對于血清miRNA-130a，死亡組和生存組較正常對照組明顯升高(P<0.05)，死亡組較生存組顯著下降(P<0.05，表2)。

表2 血清Beclin1及miRNA-130a表達分析(±s)

二、血清Beclin1及miRNA-130a對患者預(yù)后的診斷價值

通過ROC曲線分析，顯示血清Beclin1及miRNA-130a對患者預(yù)后均有一定診斷價值，曲線下面積分別為0.811、0.836(表3)。

表3 血清Beclin1及miRNA-130a對HBV-ACLF患者預(yù)后的診斷價值

討 論

HBV-ACLF屬一種特定綜合征，病情兇險，可致肝功能急性退化及其他多個器官病變，可能與免疫損傷等密切相關(guān)[7]。尋找該病早期診斷和預(yù)后指標尤為必要[8]。

本研究中，死亡組和生存組血清Beclin1較正常對照組明顯升高，可能與HBV-ACLF的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。梁振國等[9]也發(fā)現(xiàn)相較于健康體檢者，HBV-ACLF患者血清Beclin1顯著升高，證實了本結(jié)論。自噬在誘導(dǎo)細胞增殖、死亡及保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中意義重大，而Beclin1屬調(diào)控自噬現(xiàn)象的重要蛋白質(zhì)，在自噬啟動過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。筆者推測，肝細胞大量壞死及肝細胞再生障礙參與HBV-ACLF發(fā)病過程，而患者肝細胞自噬異常激活在該病的發(fā)生中意義重大。當機體出現(xiàn)不同病毒入侵時，肝細胞內(nèi)自噬功能可能不盡相同，尤其是HBV感染可經(jīng)兩種途徑(乙肝病毒X蛋白及小表面Ⅰ蛋白)引起自噬。有研究表明，HBV可激發(fā)細胞自噬水平，促使自身載量水平上升[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在啟動細胞凋亡過程中，Beclin1可被已激活的Caspase蛋白剪切，形成C端Beclin1，通過結(jié)合線粒體并大量釋放細胞色素C，致細胞凋亡[11-13]。而本文中，發(fā)現(xiàn)死亡組血清Beclin1較生存組高，且血清Beclin1對患者預(yù)后有一定診斷價值，進一步證實肝細胞自噬異常可能參與該病的發(fā)生及發(fā)展。筆者推測，細胞自噬可誘導(dǎo)HBV病毒復(fù)制增強，加速肝臟病變進行性惡化，導(dǎo)致預(yù)后較差，故而隨著病情嚴重程度的增加，血清Beclin1表達逐漸上升，影響患者預(yù)后。

本研究中，死亡組和生存組血清miRNA-130a均較正常對照組高，表明HBV-ACLF患者出現(xiàn)肝細胞受損時，大量miRNA-130a被釋放入血；而死亡組該項指標較生存組低，表明miRNA-130a與患者預(yù)后密切相關(guān)。高飛等[14]發(fā)現(xiàn)對于miRNA-130a相對表達量，健康體檢者較HBV-ACLF患者明顯下降；而死亡組該指標較生存組明顯下降，表明患者預(yù)后與血清miRNA-130a密切相關(guān)，證實了本結(jié)論。薛揚等[15]也證實對于HBV-ACLF患者預(yù)后判斷，血清miRNA-130a可納為有效生物學(xué)標志物。分析原因，該指標參與淋巴細胞定向轉(zhuǎn)移及趨化性發(fā)展，且可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、上皮細胞、中性粒細胞趨化因子受體被激活，誘導(dǎo)淋巴細胞與肝臟病變組織黏附結(jié)合[16-18]。筆者推測，患者發(fā)病時該項指標呈高表達，預(yù)示患者機體免疫反應(yīng)明顯增強，預(yù)后良好。本研究中，發(fā)現(xiàn)該指標對患者預(yù)后有一定診斷價值，進一步證實了上述結(jié)論。該指標可經(jīng)堿基互補配對特異性結(jié)合目標RNA編碼區(qū)，誘導(dǎo)RNA翻譯，調(diào)節(jié)淋巴細胞至血管內(nèi)壁的錨定融合，導(dǎo)致免疫細胞擺脫病變靶細胞束縛，產(chǎn)生免疫細胞因子，影響患者預(yù)后。