乳酸菌發(fā)酵枸杞飲料制作工藝優(yōu)化的研究

(寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司，寧夏中寧 755100）

枸杞是藥食同源的植物，是中草藥的重要成分。具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理保健功能，枸杞活性成分的研究是目前的熱點(diǎn)之一[1]。枸杞多糖作為天然植物多糖，無(wú)論在臨床應(yīng)用還是保健類食品的開(kāi)發(fā)方面都具有廣闊的市場(chǎng)前景[2]。

隨著經(jīng)濟(jì)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視食品的營(yíng)養(yǎng)保健作用，枸杞飲料作為一種功能性保健飲品越來(lái)越深受人們的喜愛(ài)[3-4]，并且隨著發(fā)酵飲料行業(yè)的發(fā)展，將枸杞進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵，制成各類乳酸菌發(fā)酵飲料已經(jīng)成為了一種全球性飲品，它的功能越來(lái)越被人們認(rèn)識(shí)，產(chǎn)品也越來(lái)越被消費(fèi)者接受[5]。

本試驗(yàn)首先對(duì)乳酸菌發(fā)酵枸杞時(shí)菌種接入量、混合菌種比例、發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化，選取風(fēng)味最好、枸杞多糖保存率含量較高的原漿發(fā)酵工藝，再將發(fā)酵原漿進(jìn)行調(diào)配，制成酸甜爽口，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的枸杞飲料，為枸杞飲料產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

材料：寧夏中寧枸杞，寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司提供；嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌，丹尼斯克公司提供。

試劑及耗材：白砂糖、檸檬酸、木聚糖酶、L-阿拉伯糖、穩(wěn)定劑，均為市售食品級(jí)，乙醇、亞硫酸鈉均為分析純。

儀器設(shè)備：TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精密儀器廠；FA1004 精密電子天平，上海天平儀器廠；FW100 型萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵枸杞原漿工藝流程（圖1）

圖1 發(fā)酵枸杞原漿工藝流程

1.2.2 發(fā)酵條件試驗(yàn)測(cè)試指標(biāo)與方法

乳酸菌接種量的確定：以發(fā)酵液pH4.01 時(shí)，作為枸杞發(fā)酵原漿的發(fā)酵終點(diǎn)，發(fā)酵溫度為40 ℃，測(cè)定不同接種量4%、5%、6%、7%、8%條件下枸杞發(fā)酵原漿多糖保存率并進(jìn)行風(fēng)味評(píng)估。

發(fā)酵溫度的確定：以發(fā)酵液pH4.01 時(shí)，作為枸杞發(fā)酵原漿的發(fā)酵終點(diǎn)，乳酸菌接種量為6 %，測(cè)定不同發(fā)酵溫度38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃條件下枸杞發(fā)酵原漿多糖保存率并進(jìn)行風(fēng)味評(píng)估。

嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例的確定：以發(fā)酵液pH4.01 時(shí)，作為枸杞發(fā)酵原漿的發(fā)酵終點(diǎn)，乳酸菌接種量為6 %，發(fā)酵溫度為42 ℃，測(cè)定嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合菌種不同比例1∶1、1∶2、1∶3，2∶1、3∶1 條件下枸杞發(fā)酵原漿多糖保存率并進(jìn)行風(fēng)味評(píng)估。

1.2.3 枸杞多糖及多糖保存率的測(cè)定

枸杞多糖的測(cè)定：取1 mL 樣品加入到85%vol濃度的乙醇中沉淀2 h，8000 r/min離心5 min，棄上清留沉淀，用5 mL丙酮洗滌沉淀兩次后，以8000 r/min離心5 min，棄上清留沉淀。用5 mL 乙醚洗滌沉淀，4000 r/min 離心10 min，棄上清液留沉淀，等沉淀?yè)]發(fā)至干后溶解于10 mL 蒸餾水中待測(cè)。按參照文獻(xiàn)[6]所述方法對(duì)枸杞多糖進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 發(fā)酵枸杞飲料的制備工藝（圖2）

1.2.5 發(fā)酵枸杞飲料單因素試驗(yàn)

圖2 發(fā)酵枸杞飲料的制備工藝

發(fā)酵枸杞原漿添加量對(duì)發(fā)酵枸杞飲料口感的影響：取9%的白砂糖，0.3%阿拉伯糖，加RO 水至200 mL，用檸檬酸調(diào)pH3.7，測(cè)定5 %、7 %、9 %、11 %、13 %發(fā)酵枸杞原漿添加量對(duì)飲料口感的影響。

白砂糖的添加量對(duì)發(fā)酵枸杞飲料口感的影響：取9 %發(fā)酵枸杞原漿，0.3 %阿拉伯糖，加RO 水至200 mL，用檸檬酸調(diào)pH3.7，測(cè)定5 %、7 %、9 %、11%、13%白砂糖添加量對(duì)飲料口感的影響。

檸檬酸的添加量對(duì)發(fā)酵枸杞飲料口感的影響：取9 %發(fā)酵枸杞原漿，0.3 %阿拉伯糖，9 %的白砂糖，加RO 水至200 mL，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值，測(cè)定pH值為3.3、3.5、3.7、3.9、4.1時(shí)飲料的口感。

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，選取發(fā)酵枸杞原漿添加量（A）、白砂糖添加量（B），檸檬酸添加量（C）為影響因素，配制后飲料口感為響應(yīng)值，每個(gè)因素取3 個(gè)水平，軸向點(diǎn)設(shè)為±1，進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，取其平均值，各試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平

1.2.6 發(fā)酵枸杞飲料感官評(píng)定

以發(fā)酵枸杞飲料的滋味、口感、氣味、色澤為評(píng)價(jià)指標(biāo)，開(kāi)展人工感官評(píng)定。分別邀請(qǐng)10 名男性和10 名女性人員，年齡階段隨機(jī)，身體健康，感官靈敏，并通過(guò)培訓(xùn)，評(píng)定前30 min 要潔口，飲食清淡，不抽煙，品嘗每個(gè)樣品前需使用純凈水漱口，最后得分取20 名評(píng)定人員的平均分?jǐn)?shù)。感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵枸杞飲料感官評(píng)分表

1.2.7 發(fā)酵枸杞飲料成分測(cè)定

飲料中蛋白質(zhì)的測(cè)定，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5；飲料中脂肪的測(cè)定，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.6；飲料中碳水化合物的測(cè)定，按參考文獻(xiàn)[7]中對(duì)飲料碳水化合物的測(cè)定；飲料中枸杞多糖的測(cè)定，參考材料與方法1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌接種量的確定(圖3)

由圖3 可以看出，多糖的保存率隨著乳酸菌接種量的逐漸增加而減小，這是因?yàn)槿樗峋鷮⒍嗵穷愇镔|(zhì)分解成乳酸，導(dǎo)致多糖含量降低。在乳酸菌接種量在4 %～7 %之間，多糖的保存率的下降趨勢(shì)較為平緩，同時(shí)也可看出枸杞發(fā)酵原漿在乳酸菌接種量為6%時(shí)，其風(fēng)味值達(dá)到了最高。為了保證風(fēng)味值好，多糖保存率較高，最終選定乳酸菌的接種量為6%。

圖3 乳酸菌接種量對(duì)枸杞多糖保存率和原漿風(fēng)味的影響

2.2 發(fā)酵溫度的確定(圖4)

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)枸杞多糖保存率和原漿風(fēng)味的影響

由圖4 可以看出，發(fā)酵溫度對(duì)多糖保存率的影響并不是很顯著，發(fā)酵溫度在44 ℃時(shí)，多糖保存率達(dá)到最低，這可能是因?yàn)樵跍囟葹?4 ℃時(shí)，混合菌的發(fā)酵效率最高，對(duì)多糖的分解也達(dá)到最高[8]。從圖4 還可看出，在發(fā)酵溫度為44 ℃時(shí)，枸杞發(fā)酵原漿擁有良好的風(fēng)味，與42 ℃發(fā)酵條件下相比，其風(fēng)味相差并不大。鑒于42 ℃下枸杞發(fā)酵原漿擁有較高的枸杞多糖保存率以及良好的感官評(píng)分，因此，選定發(fā)酵溫度為42 ℃。

2.3 嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例的確定(圖5)

由圖5 可看出，枸杞多糖保存率在嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例1∶3 條件下最低，2∶1條件下最高，其他混合比例下多糖保存率都具有一定的差異性，造成這種現(xiàn)象的原因可能是不同乳酸菌對(duì)多糖的分解能力不同。在兩種菌混合比例為2∶1時(shí)，其風(fēng)味值也同時(shí)達(dá)到了最高，因此最終確定嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例為2∶1。

圖5 嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例對(duì)枸杞多糖保存率和原漿風(fēng)味的影響

2.4 發(fā)酵枸杞飲料單因素試驗(yàn)結(jié)果(圖6、圖7)

圖6 枸杞發(fā)酵原漿、白砂糖添加量對(duì)枸杞飲料口味影響

圖7 檸檬酸添加量對(duì)枸杞飲料口味影響

由圖6、圖7 可以看出，不同調(diào)配方式，其飲料的感官風(fēng)味各不相同。選取各因素下飲料風(fēng)味值最高的條件，初步確定發(fā)酵枸杞飲料的配制方案為：發(fā)酵枸杞原漿添加量大致為7 %，白砂糖添加量大致為9%，飲料pH值3.7。

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

按照表1 用Box-Behnken 軟件(V8.0.6) 設(shè)計(jì)的3因素3水平實(shí)驗(yàn)方案（表3）。

用Design-Expert 軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到發(fā)酵枸杞飲料感官評(píng)定（Y）相對(duì)于發(fā)酵枸杞原漿添加量（A）、白砂糖添加量（B），檸檬酸添加量（C）的多項(xiàng)回歸方程為：

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

由表4的分析結(jié)果可以知，在一次項(xiàng)中，A對(duì)枸杞發(fā)酵飲料口感的影響極顯著（P＜0.01）；B對(duì)枸杞發(fā)酵飲料口感的影響顯著（P＜0.05）；C對(duì)枸杞發(fā)酵飲料口感的影響為極顯著（P＜0.01）；AB、AC、BC這3對(duì)交互作用的分析中均為極顯著（P＜0.01），由此可知，各個(gè)因素與響應(yīng)值不僅是單純的線性關(guān)系。在該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，R2＝0.9920，實(shí)驗(yàn)誤差較小，模型為極顯著（P＜0.0001），說(shuō)明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好。

回歸方程一次項(xiàng)回歸系數(shù)絕對(duì)值大小依次為枸杞發(fā)酵原漿（A）、檸檬酸添加量（B）、白砂糖添加量（C）。整體模型的回歸系數(shù)R2＝0.9641，說(shuō)明模型響應(yīng)發(fā)酵枸杞飲料感官評(píng)分變化95.36%來(lái)自所選因素變量。

2.6 兩因素之間的交互作用

由以上得出的模型可以做出響應(yīng)面圖和等高線圖(圖8—圖10)，各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可以通過(guò)組圖直觀表現(xiàn)出來(lái)。等高線圖反映了交互作用的強(qiáng)弱[9-10]，通過(guò)分析等高線圖可以得出每?jī)蓚€(gè)因素中對(duì)飲料口感影響較大的因素。

表4 枸杞發(fā)酵飲料感官評(píng)定回歸模擬方差分析

圖8 發(fā)酵枸杞原漿添加量、白砂糖添加量響應(yīng)面及等高線

圖9 發(fā)酵枸杞原漿添加量、檸檬酸添加量響應(yīng)面及等高線

圖10 檸檬酸添加量、白砂糖添加量響應(yīng)面及等高線

從圖8 可以看出，發(fā)酵枸杞原漿、白砂糖添加量的過(guò)高和過(guò)低都不利于發(fā)酵枸杞飲料口感的提升；發(fā)酵枸杞原漿添加量和白砂糖添加量等高線趨近橢圓，說(shuō)明兩者之間交互作用明顯。從圖9 可以看出，過(guò)高和過(guò)低的發(fā)酵枸杞原漿、檸檬酸添加量同樣不利于發(fā)酵枸杞飲料口感的提升；發(fā)酵枸杞原漿添加量和檸檬酸添加量等高線趨近橢圓，說(shuō)明兩者之間交互作用明顯；從圖10 可以看出，白砂糖添加量對(duì)整體口感的影響并沒(méi)有檸檬酸添加量所造成的影響大；兩者的等高線趨近橢圓，說(shuō)明兩者之間同樣有交互作用。

2.7 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)設(shè)計(jì)所得模型分析可得，枸杞發(fā)酵飲料調(diào)配方案為：發(fā)酵枸杞原漿添加量6.86 %，白砂糖添加量9.09 %，檸檬酸調(diào)節(jié)飲料pH3.65，發(fā)酵枸杞飲料感官評(píng)分可達(dá)到95.78 分。為驗(yàn)證響應(yīng)面結(jié)果所得可靠性，根據(jù)實(shí)際操作，將發(fā)酵枸杞原漿添加量修正為6.8 %，白砂糖添加量9.1 %，檸檬酸調(diào)節(jié)飲料pH3.7；實(shí)際所得枸杞發(fā)酵飲料感官評(píng)分為95分，與模型相差0.81 %，說(shuō)明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)，探討了含有較高枸杞多糖保存率和風(fēng)味適宜枸杞原漿發(fā)酵的工藝。研究表明，當(dāng)乳酸菌的接種量為6%，嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例為2∶1，發(fā)酵溫度為42 ℃，所發(fā)酵出的枸杞原漿多糖保存率較高且風(fēng)味適宜。

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，探討了發(fā)酵枸杞飲料的調(diào)配工藝。研究表明，發(fā)酵枸杞原漿添加量為6.8%，白砂糖添加量9.1 %，檸檬酸調(diào)節(jié)飲料pH3.7，所調(diào)配出的發(fā)酵枸杞飲料色澤均勻，帶有純正枸杞發(fā)酵香味，口感順滑，是一款具枸杞發(fā)酵風(fēng)味的獨(dú)特飲料。