沉默甲基轉移酶樣7B基因表達抑制腎母細胞瘤細胞的增殖、侵襲和遷移

王仲秋，耿 莉，李承學，郝希偉

腎母細胞瘤是兒童常見的惡性腫瘤之一，占所有兒童腎臟腫瘤的95%，其發病率約為1/10 萬人[1]。臨床上，約10%的腎母細胞瘤患者會發生轉移或在術后出現復發，預后較差[1]。深入分析腎母細胞瘤的發生和發展機制，對指導臨床診療具有重要的意義。甲基化轉移酶與腎母細胞瘤密切相關，其基因多態性可能影響疾病易感性[2]。甲基轉移酶樣7B（methyltransferase-like 7B，METTL7B）是甲基轉移酶樣家族成員之一，其基因位于人類12 號染色體上，編碼的蛋白廣泛表達于人體各組織。既往研究發現，METTL7B與膠質瘤、甲狀腺癌、乳腺癌和非小細胞肺癌的發生和發展有關[3-6]。既往鮮見METTL7B 與腎母細胞瘤相關的研究報道，因此本研究首先檢測了腎母細胞瘤組織中METTL7B 的表達情況，并且分析了METTL7B 表達與臨床病理特征和預后的關系，隨后采用小RNA 干擾技術靶向沉默METTL7B基因，同時探討其對腎母細胞瘤細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

人腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞和正常腎上皮細胞系（PCS-400-010、PCS-400-011 和PCS-400-012）均購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。用含10%胎牛血清的DMEM 培養液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中進行培養，每3 d 換液1 次，當SK-NEP-1 細胞融合度達80%時進行傳代。

DMEM 培養液、胎牛血清、Tris/EDTA 修復液和SP 免疫組織化學檢測試劑盒購自上海語純生物科技有限公司。脂質體轉染試劑LipoFiterTM購自美國Sigam 公司。兔抗人METTL7B 和GAPDH（內參照）單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 購自英國Abcam 公司；反轉錄試劑盒、2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、CCK-8 試劑盒、Transwell 小室和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的Annexin Ⅴ（Annexin Ⅴ-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。siMETTL7B 和陰性對照（negative control，NC）siRAN（siNC）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

組織冷凍切片機（BL-800 W 型）和流式細胞儀（LSR Ⅱ型）為美國BD 公司產品，實時熒光定量PCR 儀（ABI7500 型）為美國賽默飛公司產品，化學發光成像分析系統（ChemiDoc XRS 型）為美國Bio-Rad 公司產品，光學顯微鏡（CX33 型）為日本奧林巴斯公司產品。

1.2 組織樣本

以2008 年1 月—2013 年6 月山東第一醫科大學附屬濟南人民醫院兒科收治的72 例腎母細胞瘤患者為研究對象，其中男性29 例、女性43例；平均年齡為（3.62±1.03）歲（范圍：10 月齡～12 歲）；美國兒童腫瘤協作組（Children’s Oncology Group，COG）分期為I～Ⅱ期者40例，Ⅲ～Ⅴ期者32 例；病理分型為預后良好型（favorable histology，FH）者38 例，預后不良型（unfavorable histology，UFH）者34 例。所有患者均接受手術聯合放化療的綜合治療方法，并經術后病理確診。將手術切除的腎母細胞瘤組織及其配對的癌旁正常腎組織（距離腫瘤組織邊緣＞5 cm）制作成石蠟標本，切片厚度為4 μm。

1.3 隨訪

術后對所有患者進行門診和電話隨訪，記錄生存情況。術后第1～2 年，每3 個月復查1 次；術后第3 年，每4 個月復查1 次；術后第4 年，每6 個月復查1 次；術后第5 年及以后，每年復查1 次。隨訪截止日期為2019 年6 月30 日。

1.4 免疫組織化學法檢測METTL7B 的表達情況

取腎母細胞瘤組織及其配對的癌旁正常腎組織石蠟切片，70 ℃烤片30 min，常規脫蠟處理。用Tris/EDTA 修復液進行抗原修復，隨后用含羊血清的封閉液封閉處理30 min；加入兔抗人METTL7B 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶500），4 ℃孵育過夜；隨后加入二抗和鏈霉素-卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；最后用DAB 顯色，并進行蘇木精復染。經過脫水、透明和封片處理等步驟后，在光學顯微鏡下觀察細胞染色情況。每一張切片隨機選取10 個視野，每一個視野計數100 個細胞，根據細胞的染色強度及陽性細胞所占百分比判斷METTL7B 蛋白的表達情況。染色強度評分：陰性為0 分、淺黃色為1 分、棕黃色為2 分、棕褐色為3 分；陽性細胞所占百分比評 分：0%～10% 為1 分、11%～50% 為2 分、51%～80%為3 分、81%～100%為4 分；將染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分相乘，0～3 分代表低表達，4～12 分代表高表達[7]。

1.5 蛋白質印跡法檢測細胞中METTL7B 蛋白的表達水平

取對數生長期的各組細胞（SK-NEP-1、PCS-400-010、PCS-400-011 和PCS-400-012），加入蛋白裂解液，冰上裂解25 min，12 000×g離心15 min 后收集上清液；用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。取適量蛋白行10% SDS-PAGE 分離蛋白，并將分離后的蛋白轉移至PVDF 膜上，用封閉液封閉處理1 h；加入一抗[兔抗人METTL7B單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶500）和兔抗人GAPDH 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）]，4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，隨后加入二抗[辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶500）]，溫室孵育2 h，再用TBST 洗膜3 次。最后加入電化學發光劑顯影成像，用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參照蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 細胞轉染

SK-NEP-1 細胞培養至融合度為80%時，除去培養液，用PBS 洗滌細胞2 次。加入1 mL胰蛋白酶消化處理1 min 后加入2 mL DMEM培養液，將細胞吹打成細胞懸液，以5×102個/mL 的密度將細胞接種至6 孔板中，置于37 ℃、CO2體積分數為5% 的條件下培養24 h；用無血清培養液分別稀釋LipoFiter 和siMETTL7B（或siNC）后將2 者混勻，靜置5 min；將混合物加入6 孔培養板中進行轉染，6 h 后進行后續實驗，具體流程參數參閱試劑盒提供的操作說明。siMETTL7B 正義鏈序列為5’-AUUAGAUCCAUAGUCAUACGG-3’，反義鏈序列為5’-GUAUGACUAUGGAUCUA AUUC-3’；siNC 正義鏈序列為5’-GAUGAUUC CUUCAGGGUUA-3’，反義鏈序列為5’-GCA CAAACCCAGGCUAUUU-3’。

1.7 實時熒光定量PCR 檢測METTL7B 基因的沉默效率

采用TRIzol 法提取細胞中的總RNA，通過反轉錄獲取cDNA，隨后用實時熒光定量試劑盒進行PCR 擴增。PCR 擴增條件為95 ℃30 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共40 個循環。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，用2-△△Ct法計算METTL7B mRNA 相對表達量。METTL7B基因上游引物序列為3’-C GAGCTGAGTGCGTCCTGTC-5’，下游引 物序列為3’-TCGCTGGCCGTGAGTCTGT--5’；GAPDH基因（內參照）上游引物序列為5’-CTAC AATGAGCTGCGTGTGGC-3’，下游引物序列為5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’。

1.8 克隆形成實驗和CCK-8 法檢測細胞的增殖活力

克隆形成實驗：使用胰蛋白酶消化轉染后的SK-NEP-1 細胞，收集細胞接種于6 孔板中（3×103個/孔），置于37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養3 周；當出現菌落時，停止培養[8]；使用4%多聚甲醛溶液固定SK-NEP-1 細胞，30 min 后用結晶紫染色；將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，光學顯微鏡下計數＞50 個細胞的克隆數。

CCK-8 實驗：使用CCK-8 試劑盒檢測SKNEP-1 細胞增殖活性；細胞培養24、48 和72 h時，向每一個培養孔中避光加入5 μL CCK-8 溶液，培養2 h，用酶標儀（490 nm 波長）讀取吸光度值[9]。實驗重復3 次。

1.9 FCM 法檢測細胞凋亡情況

取對數生長期的SK-NEP-1 細胞，制成1×106個/mL 的細胞懸液，隨后加 入5 μL FITC-Annexin Ⅴ，混勻后再加入5 μL PI，溫室下避光孵育10 min 后，使用FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3 次。

1.10 Transwell 小室實驗檢測細胞的侵襲能力

在Transwell 小室的上室膜上鋪設matrigel，隨后將細胞接種于Transwell 小室的上室中（1×103個/孔）；下室中加入細胞培養液。培養48 h 后取出Transwell 小室，用棉簽擦拭除去未穿過小室膜的細胞，使用多聚甲醛溶液固定黏附于下室微孔膜下面的SK-NEP-1 細胞，用結晶紫染色15 min，待干燥后，在光學顯微鏡（放大倍數為100 倍）下選取5 個視野，觀察染色細胞的形態并計數。

1.11 細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力

取對數生長期的SK-NEP-1 細胞接種于細胞培養板中，待SK-NEP-1 細胞融合度達80%時，用無菌槍頭進行劃痕。分別于0 和24 h 時，在光學顯微鏡下測量劃痕寬度并拍照。劃痕愈合率（%）＝（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%[10]。實驗重復3 次。

Fig.1 The expression levels of methyltransferase-like 7B (METTL7B) protein in nephroblastoma tissues and their normal adjacent kidney tissues (A) and nephroblastoma SK-NEP-1 cells and normal renal epithelial cells (PCS-400-010,PCS-400-011 and PCS-400-012) (B) were detected by immunohistochemistry(DAB staining,×200) and Western blotting,respectively. *P＜0.05,vs SK-NEP-1 cells.圖1 分別采用免疫組織化學法和蛋白質印跡法檢測METTL7B 蛋白在腎母細胞瘤組織及其癌旁正常腎組織（A）和腎母細胞瘤細胞（B）中的表達水平

1.12 統計學方法

應用SPSS 20.0 軟件對所有的實驗數據進行統計學分析。組間計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（組內比較采用LSD-t檢驗）；生存分析采用Kaplan-Meier 法，預后相關因素的單因素和多因素分析采用COX風險比例模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

1.13 倫理學

本研究通過山東第一醫科大學附屬濟南人民醫院倫理委員會批準?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺?。

2 結果

2.1 METTL7B 在腎母細胞瘤組織和細胞中的表達

免疫組織化學法檢測結果（圖1A）顯示，METTL7B 陽性染色可見于細胞核和細胞質中。腎母細胞瘤組織中METTL7B 高表達，陽性表達率為68.06%（49/72），高于癌旁正常腎組織的16.67%（12/72）（χ2＝38.937，P＜0.001）。

蛋白質印跡法檢測結果（圖1B）顯示，SK-NEP-1 細胞中METTL7B 蛋白的表達量為2.78±0.12，明顯高于PCS-400-010 細胞的0.45±0.23、PCS-400-011 細胞中 的0.37±0.14以及PCS-400-012 細胞的0.38±0.24 細胞（F＝39.090，P＜0.001）。

2.2 METTL7B 與腎母細胞瘤患者臨床病理特征和預后的關系

統計分析結果（表1）顯示，METTL7B 與COG 分期有關（P＜0.05），而與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑和病理分型均無關（P均＞0.05）。

表1 METTL7B 表達與腎母細胞瘤患者臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between methyltransferase-like 7B (METTL7B) expression and clinicopathological features of patients with nephroblastoma(N ＝72,n)

COX單因素和多因素分析結果（表2）顯示，COG 分期為Ⅲ～Ⅳ期、病理分型為UFH 型和METTL7B 高表達是腎母細胞瘤不良預后的獨立影響因素（P＜0.05）。

表2 腎母細胞瘤患者預后的單因素和COX 多因素分析Table 2 Univariate and COX multivariate analyses of prognosis of patients with nephroblastoma

Fig.2 Kaplan Meier method was used to analyze the correlation between methyltransferase-like 7B(METTL7B) expression and overall survival (OS) of patients with nephroblastoma.圖2 Kaplan-Meier 法分析METTL7B 表達與腎母細胞瘤患者生存的相關性

Fig.3 The expression levels of methyltransferase-like 7B (METTL7B) mRNA (A) and protein (B) in SK-NEP-1 cells transfected with siMETTL7B targeting METTL7B gene were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.SK-NEP-1 cells were transfected with siRNA negative control (NC) (siNC) as the control.*P＜0.05,vs siNC group (n=3).圖3 分別采用實時熒光定量PCR 法和蛋白質印跡法檢測SK-NEP-1 細胞中METTL7B mRNA（A）和蛋白（B）的表達水平

Kaplan-Meier 生存曲線分析結果（圖2）顯示，METTL7B 高表達患者的生存時間短于METTL7B 低表達的患者（P＜0.05）。

2.3 沉默METTL7B 基因表達對SK-NEP-1 細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響

實時熒光定量PCR 檢測結果（圖3A）顯示，在SK-NEP-1 細胞中，siNC 組和siMETTL7B組的METTL7B mRNA 表達量分別為1.89±0.11和0.57±0.12；與siNC 組相比，siMETTL7B組METTL7B mRNA 的表達水平明顯下調（P＜0.001）。

蛋白質印跡法檢測結果（圖3B）顯示，在SK-NEP-1 細胞中，siNC 組 和siMETTL7B 組的METTL7B 蛋白表達量分別為2.34±0.34 和0.68±0.23；與siNC 組相比，siMETTL7B 組METTL7B 蛋白的表達水平明顯下調（P＜0.001）。

克隆形成實驗檢測結果（圖4A）顯示，siNC組和siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的克隆形成數分別為（240.56±35.10）個和（123.12±27.80）個；與siNC 組相比，siMETTL7B 組的克隆細胞數明顯減少（P＝0.001）。

CCK-8 法檢測結果（圖4B）顯示，72 h 時siNC 組和siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的D值分別0.52±0.08 和0.28±0.07，96 h 時siNC組 和siMETTL7B 組SK-NEP-1細胞的D值分別0.74±0.09 和0.39±0.07；與siNC 組相比，siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的增殖能力受到明顯抑制（P均＜0.001）。

FCM 法檢測結果（圖4C）顯示，siNC 組和siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的凋亡率分別為（9.80±3.11）%和（21.25±5.34）%；與siNC 組相比，siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的凋亡率明顯升高（P＝0.006）。

Transwell 小室法檢測結果（圖4D）顯示，siNC 組和siMETTL7B 組發生侵襲的SK-NEP-1細胞數分別為（312.90±78.89）個和（198.70±50.23）個；與siNC 組相比，siMETTL7B 組SKNEP-1 細胞的侵襲能力受到明顯抑制（P＝0.013）。

細胞劃痕實驗檢測結果（圖4E）顯示，siNC組和siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的劃痕愈合率遷移率分別為（39.23±12.10）%和（19.34±7.11）%；與siNC 組相比，siMETTL7B 組SKNEP-1 細胞的遷移能力受到明顯抑制（P＝0.030）。

Fig.4 Effects of silencing methyltransferase-like 7B (METTL7B) gene on proliferation,apoptosis,invasion and migration of SK-NEP-1 cells.A: The proliferation of SK-NEP-1 cells was detected by clone formation experiment.B: The proliferation of SK-NEP-1 cells was detected by CCK-8 method.C: The apoptotic rate of SK-NEP-1 cells was detected by flow cytometry (FCM) method.D: The invasion ability of SK-NEP-1 cells was detected by Transwell assay.E: The migration ability of SK-NEP-1 cells was detected by scratch healing experiment.siMETTL7B group: SK-NEP-1 cells were transfected with siMETTL7B targeting METTL7B gene;siNC group: SK-NEP-1 cells were transfected with siRNA negative control (NC)as the control.*P＜0.05,vs siNC group (n=3).圖4 沉默METTL7B 基因表達對SK-NEP-1 細胞增殖（A 和B）、凋亡（C）、侵襲（D）和遷移（E）的影響

3 討論

腎母細胞瘤是兒童常見的實體腫瘤之一，嚴重威脅患兒的生命健康。近年來，隨著手術及放化療技術的發展，腎母細胞瘤的預后已得到明顯改善[11]。然而，侵襲性生長和遠處轉移仍然是影響腎母細胞瘤預后的主要因素，因此有必要對其機制進行深入探討。

METTL7B 是甲基轉移酶樣家族成員之一。既往研究發現，甲基轉移酶樣家族成員具有多種生物學功能，例如METTL3、METTL16、METTL2B 和METTL8 屬 于RNA 甲基轉 移酶，其在結直腸癌和肝細胞癌等腫瘤的發生和發展中發揮重要作用[12-15]。METTL7B 屬于高爾基體相關的甲基轉移酶[6]，可能在腫瘤進展中發揮重要作用，然而既往相關報道較少。有研究發現，METTL7B 能夠通過誘導上皮-間質轉化的發生，進而增強甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[4]。LIU 等[6]研究發現，METTL7B 可以調控非小細胞肺癌的細胞周期，沉默METTL7B基因表達可誘導腫瘤細胞發生G0/G1期停滯。對乳腺癌的研究也發現，METTL7B 可作為RhoBTB1的靶分子，在乳腺癌細胞的增殖和侵襲中發揮作用[5]。

當前，有關METTL7B 在腎母細胞瘤中的表達及其機制的研究尚鮮有報道。本研究首先檢測了72 例腎母細胞瘤組織及其配對的癌旁正常腎組織中METTL7B 的表達情況，結果顯示腎母細胞瘤組織中METTL7B 的陽性表達率高達68.06%（49/72），高于癌旁正常腎組織中的16.67%（12/72）。此外，與人腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞相比，正常腎上皮細胞PCS-400-010、PCS-400-011 和PCS-400-012 中METTL7B 蛋白的表達水平均明顯偏低，說明METTL7B可能作為癌基因在腎母細胞瘤的發生中發揮作用。與腎母細胞瘤預后相關的因素包括年齡、腫瘤分期、病理類型和腫瘤大小等[16-18]。本研究結果顯示，METTL7B 與腎母細胞瘤COG 分期和不良預后相關，說明METTL7B 可能參與腎母細胞瘤的惡性進展。腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡與腫瘤惡性進展密切相關[19-20]。為進一步明確METTL7B 在腎母細胞瘤中的作用，本研究采用小RNA 干擾技術靶向沉默METTL7B基因的表達，結果顯示沉默METTL7B 表達后SK-NEP-1細胞的增殖、侵襲和遷移能力均明顯受到抑制，而細胞凋亡率增加。

綜上所述，METTL7B 在腎母細胞瘤組織和細胞中高表達，METTL7B 與腎母細胞瘤COG分期和不良預后相關。沉默METTL7B 表達可能會抑制腎母細胞瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，并促進其凋亡。本研究也存在一些局限，例如未檢測METTL7B 下游指標的變化，未分析METTL7B 對腎母細胞瘤細胞細胞周期的影響，未檢測METTL7B 在腎母細胞瘤患兒血清中的表達情況。因此，有待進一步研究METTL7B 在腎母細胞瘤早期診斷中的價值?？傊?，METTL7B可能會成為腎母細胞瘤的分子生物學標志物，未來需要對其生物學機制進行深入探討。