貴州漢族人群21個非CODIS STR基因座的遺傳多態性分析*

張紅玲， 蔡鵬， 熊玲， 羅文鈺， 楊美慶， 徐榮蘭， 王啟燕， 任崢， 季晶焱， 黃江

(貴州醫科大學 法醫學院， 貴州 貴陽 550004)

短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)是一類在人類基因組中分布較廣的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)串聯重復序列，由于其等位基因長度較短、重復次數較少，具有高鑒別能力，因此是法醫學領域中親權鑒定和個體識別、以及群體遺傳研究常用的遺傳標記[1]。目前法醫物證檢驗中通用的試劑盒所包含的基因座數目通常在20個左右，這些試劑盒以DNA檢索系統(combined DNA index system，CODIS)中的基因座為基礎，在疑難案件或復雜親緣關系鑒定時，常常需要增加檢測的基因座[2]。目前已有學者利用AGCU21+1熒光檢測試劑盒對部分人群進行了研究，表明不同民族不同地理位置人群STR基因頻率有所不同[3-11]，而對貴州地區人群的非CODIS STR基因座未見報道。因此，本文利用該試劑盒獲取貴州地區漢族人群的21個非CODIS系統STR群體遺傳學參數，為法醫學親權鑒定和個體識別提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 從學校法醫司法鑒定中心日常檢案中篩選出301例貴州漢族無關個體血樣。所有檢材均經過知情同意原則，人體倫理道德由學校人體試驗倫理委員會審批(NO.201974)。

1.1.2主要試劑和儀器 AGCU21+1熒光檢測試劑盒(無錫中德美聯生物技術有限公司)，Veriti型基因擴增儀和3500型全自動遺傳分析儀(美國 AB公司)。

1.2 方法

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增按照AGCU21+1熒光檢測試劑盒用戶手冊進行。反應體系為10 μL：Reaction Mix 4.0 μL，Primers21+12 μL，熱啟動C-Taq酶(5 U/μL)0.3 μL，ddH2O 3.7 μL，模板 DNA為直徑1 mm的紙片。反應條件：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10個循環；90 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，20個循環，60 ℃延伸60 min。采用3500遺傳分析儀對PCR擴增產物進行電泳分離，GeneMapper ID-X1.3軟件對STR基因分型結果進行分析。

1.3 統計學分析

數據處理采用 Modified-Powerstates軟件包[12]，獲得各基因座的等位基因頻率、雜合度(heterozygosity，H)、匹配概率(matching probability，PM)、個體識別率(power of discrimination，DP)、非父排除率(power of exclusion，PE)、多態信息含量(polymorphism information content，PIC)；累積個體識別能力(total discrimination power，TDP)和累積非父排除率(combined power of exclusion，CPE)，以及各基因座Hardy-Weinberg平衡檢驗。應用Genepop軟件(https://genepop.curtin.edu.au/genepop_op2.html)，對兩兩基因座進行連鎖不平衡分析。選擇7個地區的漢族人群作為參考[13-19]，基于各人群基因頻率，應用MultiVariate Statistical Package(MVSP)軟件對8個人群進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，并應用R對PCA結果進行圖示化。應用GENETIC DISTANCE AND PHYLOGENETIC ANALYSIS(DISPAN)軟件計算8個人群之間的Nei氏遺傳距離(Nei’s gentic distance，DA)值，基于DA值應用MEGA 7.0軟件Neighbor-Joining(N-J)法構建8個地區漢族人群系統發育樹。

2 結果

2.1 基因頻率

貴州漢族301例無關個體的21個常染色體STR基因座的等位基因頻率分布結果顯示，各基因座頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)；21個基因座位點兩兩比較均未見連鎖不平衡。見表1。

表1 貴州漢族21個常染色體STR的等位基因頻率Tab.1 Allelic frequencies for the 21 STR loci in Guizhou Han people

2.2 遺傳學參數

貴州漢族301例個體的21個常染色體STR基因座共檢測出了157個等位基因，436種基因型；21個常染色體的 STR 基因座遺傳多態性均較高，H介于0.584 7(D1S1627)～0.807 3(D2S441)，PM介于0.052 6(D19S433)～0.226 8(D1S1627)，DP介于0.773 2(D1S1627)～0.947 4(D19S433)，PE介于0.272 9(D1S1627)～0.586 7(D22S1045)，PIC介于0.533 2(D1S1627)～0.803 0(D19S433)；TDP為1-4.645 5×10-20，CPE為0.999 998 822。貴州漢族人群21個STR基因座的遺傳學參數見表2。

表2 貴州漢族人群21個STR基因座的遺傳學參數Tab.2 Genetic parameters for the 21 STR loci in Guizhou Han peoole

2.3 貴州漢族與其他地區漢族人群比較

基于基因頻率進行主成分分析結果顯示(圖1)，其中PC1和PC2的貢獻率分別為75%和11.5%，兩個成分的累計貢獻率為86.5%，解釋了8個人群間基因頻率遺傳結構差異約87%的信息；從主成分分析散點圖中可以看出，貴州、北方、關中、河南、湖南及浙江漢族6個人群分布較為集中，位于PCA圖的左下方；而成都和寧夏漢族與其他6個漢族人群距離較遠，分別位于PCA圖的左上方以及右下方；在8個漢族人群中，本文研究的貴州與湖南漢族人群距離最近，與寧夏漢族人群距離最遠。根據遺傳距離DA構建N-J系統發育樹結果發現(圖2)，除貴州和湖南漢族外，其余6個漢族人群單獨聚為一支。

圖1 貴州與其他7個地區漢族人群的主成分分析圖Fig.1 PCA of Guizhou Han and 7 Chinese Han people of other areas

圖2 貴州與其他7個地區漢族人群N-J系統發育樹Fig.2 N-J phylogenetic tree between Guizhou Han and 7 Chinese Han people of other areas

3 討論

1990年起，美國聯邦調查局(Federal Bureau of Investigation，FBI)為了搜尋犯罪嫌疑人及串、并案的偵察，開始實行聯合CODIS計劃，篩選了13個常染色體STR基因座作為核心基因座[20-21]。目前，常染色體STR遺傳標記在法醫學實踐中已得到廣泛應用。為保證DNA數據的有效性、異地查詢及DNA實驗室間比對的需要，大部分商品化的STR試劑盒均以這13個基因座為基礎構建，但CODIS系統中部分基因座在我國的人群中的非父排除概率及個人識別能力較低，而影響了整個系統效能，為此需要選擇一些非CODIS系統的基因座作為這些商品化試劑盒的有效補充。

為了滿足標準化、數據庫建設及實驗室間比對的要求，建議增加的基因座選用商品化的試劑盒，本文對AGCU21+1熒光檢測試劑盒中包含的D6S474等21個常染色體 STR 基因座進行基因分型結果統計分析，結果表明21個常染色體STR基因座，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。除了D1S1627、D1GATA113、D1S1677、D9S1122、D17S1301及D6S474這6個基因座為中等鑒別能力的基因座外，其余的基因座均屬于高度多態性基因座，其TDP為1-4.645 5×10-20，CPE為0.999 998 822。結合課題組前期對包含CODIS系統的22個常染色體STR基因座(PowerPlex Fusion試劑盒)的研究[22]，2個復合擴增系統的TDP可達到1-2.424 7×10-41，CPE可達到0.999 999 999 999 962，可以滿足在疑難案件或復雜親緣關系鑒定的需要。

有研究表明，不同地理人群之間具有不同的遺傳結構[23-25]，為了明確貴州漢族與其他地區漢族的遺傳關系，本研究選擇了已報道的中國7個地區的漢族與貴州漢族進行組成分分析和遺傳距離DA分析，對于8個地區漢族人群的比較，主成分分析圖及系統發育樹均顯示貴州漢族與湖南漢族遺傳關系最近，與北方的寧夏漢族遺傳關系最遠，這與地理位置相對應。處于南方地理位置的成都及浙江漢族相較于北方河南漢族與貴州漢族的親緣關系較遠，而河南漢族、北方漢族、關中漢族與寧夏漢族雖地理位置同處于北方，但寧夏漢族與其余北方漢族關系較遠。這也說明了漢族人群因定居地不同，親緣關系也不同。漢族作為我國乃至世界人口規模最大的群體，居住地理范圍廣，地域差距大，生活習慣各異，各地方言多樣，因災害或戰爭等原因有過大規模及頻繁的人群遷移，各地的漢族人群相互或與其他民族進行基因的融合。通過分析不同地區的漢族群體遺傳多態性的差異及遺傳結構的變化，對于探索該人群的民族起源及遷移提供了分子人類學方面的科學依據及線索，有助于推進法醫學親緣關系及個人識別方面的研究。