毛竹TIP基因成員鑒定及其響應脅迫的表達分析

朱成磊 楊克彬 高志民

(國際竹藤中心竹藤資源基因科學與基因產業化研究所 國家林業和草原局/北京市共建竹藤科學與技術重點實驗室 北京 100102)

水通道蛋白(AQPs) 是一類膜蛋白，對調節水和小分子溶質通過生物膜至關重要。盡管第一個植物AQP在1987年從大豆(Glycine max) 中分離得到[1]，但第一個被證實具有功能的植物AQPs是1993年在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中發現的γ 液泡膜內在水通道蛋白(AtTIP1)[2]，之后又在多種植物中分離出不同類型的AQPs，如擬南芥、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高粱 (Sorghum bicolor) 和柳枝稷 (Panicum virgatum) 等植物分別有35、39、36、68和38個AQPs[3]?；谙到y發育分析和亞細胞定位，將維管植物AQPs分為5個亞家族，每個亞家族又可分為多個亞組。根據10個不同單子葉植物和雙子葉植物中共100個TIPs的進化分析，TIPs分為5個不同的亞組 (TIP1、TI2、TIP3、TIP4和TIP5)[4]。TIPs定位于液泡膜上，TIPs調控液泡膜水分出入，實現細胞的迅速膨脹或緊縮，液泡膜對水具有極高的滲透性，其滲透率比質膜高100倍[5]。除轉運水分外，TIPs還兼有運輸甘油[6]、H2O2[7]、NH3[8]、尿素[9]和硼[10]以及砷[11]吸收等方面的功能。因此，TIPs在響應干旱、鹽等非生物脅迫[12]以及冷適應能力[13]，維持植物正常生理活動方面均具有重要的調節作用。

AQPs廣泛存在于植物中，有的在特定組織發揮作用，許多與生物脅迫和非生物脅迫密切相關，尤其是對干旱、鹽分以及富含重金屬的土壤的耐受性[14]。基因在植物不同組織中、同一組織的不同發育階段以及脅迫條件下的表達差異，反映了基因功能方面的差異。擬南芥、水稻和玉米不同發育時期TIPs基因的表達，以及在干旱和鹽脅迫條件下的表達變化均證明了這一點[15]。毛竹基因組草圖[16]發布后，人們開始了對毛竹AQPs的研究，發現TIP同源基因的5個亞組(TIP1、TIP2、TIP3、TIP4和TIP5) 在不同組織中表達存在一定的差異[17]，且干旱、水淹和NaCl處理均能引起部分毛竹TIPs基因表達的顯著變化[18]，但尚缺乏對毛竹TIPs基因的更全面分析。隨著染色體水平毛竹基因組的發布[19]，使人們能夠對其中TIPs成員的分子特征、系統進化進行深入分析。低溫、干旱、光照等多種脅迫處理下的毛竹轉錄組數據[20-21]，便于對其中TIPs基因的表達模式進行系統了解，預測其功能。在此基礎上，采用qPCR技術對不同脅迫條件下PeTIPs的表達進行了驗證，以期為深入研究TIPs基因的功能提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 毛竹TIP基因查找

以水稻和擬南芥的TIP序列為誘餌，通過同源比對的方法在毛竹新版本基因組數據[19]中進行比對分析，對所獲得的序列利用在線軟件HMMER (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 進行保守結構域分析，保留具有完整TIP保守結構域的序列。最終獲得毛竹TIP基因成員，并根據它們與其他近緣物種的親緣關系進行命名。

1.2 毛竹TIP基因生物信息學分析

利用 ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 網站對所獲得的毛竹TIP蛋白的理化性質進行分析。運用在線軟件MEME (http://meme.nbcr.-net/meme/intro.html) 對毛竹TIP蛋白的保守基序進行分析，使用Plant-mPLoc網站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/) 和TMHMM Server v.2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 分別預測其亞細胞定位和跨膜結構域。對毛竹TIP基因上游啟動子序列(2 000 bp) 中的調控元件，利用在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 進行預測[22]。

利用TBtools[23]內置的BLASTP程序對毛竹和水稻TIP氨基酸序列進行多向比對，根據文獻設定參數[24]，鑒定出具有共線性關系的基因，通過TBtools內置的MCScanX程序[25]進行做圖。另外，對所有TIP同源基因對之間的同義(Ks) 和非同義(Ka) 核苷酸替換率進行計算。利用MEGA 7.0內置的Clustal W程序，對毛竹、擬南芥、水稻、高粱、玉米和二穗短柄草(Brachypodium distachyon)等植物的TIP氨基酸序列進行多重比對分析，根據文獻設置參數構建系統進化樹[26-27]。

1.3 非生物脅迫條件下毛竹RNA-seq數據中TIP基因的表達分析

根據文獻報道，從NCBI Short Read Archive(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) 下載低溫、干旱和強光脅迫處理毛竹的RNA-seq數據[20-21]，包括低溫或者干旱處理2 h和8 h后葉片及對照的RNA-seq數據 (登錄號為SRS1759772)，強光[1 200 μmol/ (m2·s) ]處理0.5 h和8.0 h的毛竹幼苗葉片及對照的RNA-seq數據(登錄號為SRS942689)。根據基因注釋進行比對查找，篩選其中TIP基因的FPKM (fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段值)，并對獲得FPKM進行標準化處理，取以2為底的對數 [Log2(FPKM+1)]的值作為基因的表達量，用TBtools軟件繪制表達譜熱圖，分析不同基因的表達情況。

1.4 不同脅迫條件下毛竹TIP基因的定量表達分析

在實驗室條件下(溫度25 ℃左右，光16 h/暗8 h，相對濕度80%左右) 培養毛竹實生幼苗，選擇2個月生長較一致的幼苗，隨機分成4組分別進行處理。向A組基質中添加250 mmol/L NaCl溶液至飽和狀態，B組基質中添加20% PEG 6 000溶液至飽和狀態，C組放入4 ℃的光照培養箱中，D組置于1 200 μmol/ (m2·s) 的強光培養箱中。每個處理至少20株幼苗，每個處理均包含3次重復。分別在處理后0、1、2、4、8 h后分別收集A、B和C組根系樣品以及A、B、C和D組的葉片樣品，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。選用試劑盒(Takara RNA) 提取樣品總RNA并反轉錄成cDNA，存于-20 ℃冰箱用于后續試驗。

根據毛竹TIP序列設計特異的定量引物(表1)，由北京博邁德基因技術有限公司合成。10.0 μL的qPCR反應體系:2 × SYBRⅡGreen I Master 5.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，正/反向引物0.3 μL，ddH2O 3.4 μL。擴增程序:95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，61 ℃退火10 s，循環42次。以PeNTB為內參基因[28]，定量結果采用2-ΔΔCT法[29]分析，基于TBtools軟件取以2為底的對數[Log2(FPKM+1) ]進行歸一化后繪制表達量圖。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab.1 Primer sequences of qPCR

2 結果與分析

2.1 毛竹TIP基因鑒定與蛋白理化性質分析

在毛竹新版本基因組數據中，共鑒定具有編碼完整TIP保守結構域的基因19個，根據其他物種中TIP基因的命名規則，將它們分別命名為PeTIP1-1～ PeTIP1-3、PeTIP2-1～ PeTIP2-4、PeTIP3-1～ PeTIP3-2、PeTIP4-1～ PeTIP4-7和PeTIP5-1～PeTIP5-3(表2)。PeTIPs編碼蛋白氨基酸序列最短的為238 aa (PeTIP3-2)，最長為434 aa (PeTIP5-2)，分子量介于25.06～44.03 kDa之間；理論等電點介于5.54～9.88之間，除PeTIP3-2親水性較低之外，所有PeTIPs均為穩定的親水性蛋白；大多數PeTIPs有6個跨膜結構。亞細胞定位預測顯示所有PeTIPs均定位于液泡膜上，其中PeTIP3-2還被定位在細胞質膜上。

表2 PeTIPs蛋白的理化性質分析Tab.2 Putative basic physical and chemical characteristics analyses of PeTIPs

2.2 PeTIPs氨基酸的保守性分析

氨基酸保守基序分析表明，在PeTIPs序列中共鑒定獲得7個保守基序，其中基序1、2、3和6為共有基序；PeTIP3-2缺少基序4；PeTIP5-1和PeTIP5-3缺少基序 5；PeTIP2-2、PeTIP2-3、PeTIP4-6、PeTIP4-7和PeTIP5-3均缺少基序7 (圖1A)。每個保守基序中氨基酸序列的偏好性在PeTIPs不同成員間存在著一定的差異，但大多數是比較保守的，尤其是含有跨膜區(TM 1-TM 6) 和Loop-Half螺旋區(Loop B和Loop E) 的基序更為保守(圖1B)。同一個亞組大多數成員具有相同的保守基序，說明這些成員可能存在相似的功能。

圖1 PeTIPs氨基酸保守基序分析Fig.1 Analysis of conserved motifs in PeTIPs

AQPs運輸底物具有選擇透過性，位于Loop B和Loop E處高度保守的NPA (Asn-Pro-Ala) 結構域對水分親疏性具有重要作用。對PeTIPs保守位點分析表明，所有序列均含有2個高度保守的NPA結構域，除PeTIP3-2缺少TM 2的Ar/R選擇性過濾器之外，其余序列均含有Ar/R選擇性過濾器(TM 1-TM 6) 和Froger's殘基(表3)。在底物運輸時，Ar/R選擇性過濾器是一種重要的選擇通過結構，PeTIPs 5個亞組的Ar/R選擇性過濾器組合形式均不相同，其中PeTIP1s、PeTIP2s和PeTIP5s的分別為H-I-A-V、H-I-G-R和Q-V-A-R，而PeTIP3s和PeTIP4s的Ar/R選擇性過濾器則具有多種組合形式，分別為H-M/V-A-R和Q/H-T/I-A-R等形式。氨基酸Froger's殘基在底物運輸過程同樣發揮著重要作用，PeTIPs的Froger's殘基保守性相對較高，主要為T/S-S-A-Y-W 2種形式。Ar/R選擇性過濾器的多態性和Froger's殘基的保守性預示著PeTIPs在毛竹生長發育過程中發揮著不同的功能。

2.3 PeTIPs的系統進化分析

為深入了解PeTIPs的功能，通過對毛竹、水稻、擬南芥、玉米、高粱和二穗短柄草6個物種的71條TIP氨基酸序列進行多重比對，基于MEGA 7.0的鄰接法構建了系統進化樹。結果表明，所有PeTIPs被聚類到5個分支(I-V)，且每個分支中的成員數量不等，其中I和V中均含有3個成員，II、III中分別含有4個和2個成員，IV中成員最多，為7個(圖2)。進一步分析發現，超過一半(11/19) 的PeTIPs成員被聚類在分支II和IV中，而水稻和擬南芥在這2個分支的成員分別只有5個和4個，且PeTIP4-2/PeTIP4-3、PeTIP4-4/PeTIP4-5和PeTIP4-6/PeTIP4-7均成對地聚類在1個分支上，這可能與毛竹進化中經歷了基因組復制事件有關[16]。另外，在分支V中毛竹有3個成員，而其他物種只含有1個成員，這可能是毛竹進化中經歷成員擴張。另外，PeTIPs總是優先與水稻或二穗短柄草TIP成員聚類在一起，說明PeTIPs與水稻等單子葉植物的同源蛋白的功能更相似。

表3 PeTIPs氨基酸保守位點分析Tab.3 The amino acid conserved site analysis of PeTIPs

圖2 基于不同植物TIP家族成員構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed on the base of TIP family members in different plant species

2.4 PeTIPs基因片段復制和共線性分析

基因復制在基因家族擴張過程和功能演化中均發揮重要作用，而毛竹在進化過程中也經歷了基因組復制和基因家族擴張事件[16]。相對于其他二倍體物種，毛竹TIP成員也出現了成員增多的現象(圖2)。對毛竹和水稻中TIP成員的共線性關系進行分析結果表明，共有15個PeTIPs檢測到共線性關系，其中在PeTIPs間存在10對片段重復；另外，12個PeTIPs與水稻8個TIP基因存在18對片段重復，沒有發現串聯重復以及其他重復類型的基因(圖3A)。進一步分析發現，這28對重復片段中有11對發生在PeTIP4s分支中，另外還有9對重復片段發生在PeTIP5s分支中，這些結果支持了這2個分支發生過家族擴張的推測。此外，非同義對同義取代比(Ka/Ks) 是判斷基因功能分化的重要指標，對所有具有片段重復的基因進行Ka/Ks分析結果顯示，28對TIP基因的Ka/Ks均小于1.0 (圖3B)。由此表明，PeTIPs在發生片段復制后，經歷了較強的純化選擇，功能分化差異不大。

2.5 PeTIPs啟動子序列調控元件分析

圖3 毛竹和水稻TIP基因共線性和Ka/Ks 分析Fig.3 Collinearity and Ka/Ks analyses of TIP genes in moso bamboo and rice

圖4 PeTIPs基因啟動子調控元件分析Fig.4 Analysis of regulatory elements in promoter sequences of PeTIPs

為更好地了解PeTIPs對不同逆境脅迫和植物激素的響應，對基因轉錄起始位點上游2 000 bp基因組區域內的調控元件進行了分析。結果顯示，有8類作用元件參與脅迫和防御相關反應，7類作用元件與植物激素響應相關(圖4A)。有15個基因的啟動子中包含防御相關元件(STRE)，14個基因中包含厭氧誘導響應元素(ARE)；在這些啟動子序列中還發現其他與脅迫相關的調控元件，如低氧特異增強元件(GC-motif)、低溫響應元件(LTR)、真菌誘導響應元件(W box) 和MYB轉錄因子結合元件(MBS) (圖4B)。響應植物激素的作用元件一直是人們關注的焦點，在17個和16個基因的啟動子中分別發現了脫落酸響應元件(ABRE) 和茉莉酸甲酯(MeJA) 響應元件(CGTCA motif)，在12個基因中鑒定出GA響應元件(GARE-motif和TGA-element)，而生長素響應元件(AuxRR-core) 則較少富集于PeTIPs中(圖4B)。這些結果表明，PeTIPs可能參與調節多種逆境脅迫和植物激素的應激反應。

2.6 基于非生物脅迫毛竹RNA-seq分析PeTIPs的表達模式

根據PeTIPs啟動子中調控元件分析的結果，利用已發表的毛竹RNA-seq數據，對逆境脅迫條件下葉片中PeTIPs的表達模式進行了分析。結果表明，在低溫、干旱和強光處理的毛竹葉片中，能檢測到大部分PeTIP1s和PeTIP4s的基因的表達，PeTIP2s中僅有PeTIP2-3有表達，幾乎檢測不到PeTIP3s和PeTIP5s的表達(圖5)。與處理前相比(0 h) 相比，低溫脅迫2 h后5個PeTIPs (PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP4-1、PeTIP4-2和PeTIP4-3) 表達上調，至8 h時各基因的表達量又有所下調(圖5A)；干旱脅迫下的PeTIP1-2和PeTIP4-2也表現出相似趨勢(圖5B)。在強光處理0.5 h后，PeTIP4-1、PeTIP4-2和PeTIP4-3呈現出上調表達趨勢，且至8 h時依然保持較高的表達量 (圖5C)。由此表明，PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP4-1、PeTIP4-2和PeTIP4-3可能在參與毛竹葉片響應逆境脅迫中發揮著重要作用。

圖5 不同非生物脅迫條件下毛竹葉片中PeTIPs的表達模式Fig.5 Expression profiles of PeTIPs in leaves of moso bamboo under different abiotic stresses

2.7 基于qPCR技術分析非生物脅迫下PeTIPs的表達模式

為進一步證實PeTIPs的表達模式，根據非生物脅迫的RNA-seq分析結果，選取6個(PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP1-3、PeTIP4-1、PeTIP4-2和PeTIP4-3) 在脅迫條件下葉片中表達變化的基因，采用qPCR技術進行了驗證。結果表明，隨著脅迫時間的延長，葉片中6個PeTIPs的表達呈現出一定的差異。在低溫、干旱、高鹽和強光脅迫處理下分別有2個(PeTIP4-1和PeTIP4-3)、3個(PeTIP1-3、PeTIP4-1和PeTIP4-3)、2個(PeTIP1-2和PeTIP4-2) 和1個(PeTIP4-3) 基因表現為不同程度的持續上調表達，且在脅迫處理中后期(4 h或8 h) 的表達量均顯著高于對照組(0 h)；在高鹽脅迫下的2個基因(PeTIP1-1和PeTIP1-3) 則表現為先上升后下降的趨勢，在脅迫處理4 h時表達量達到最高；此外，PeTIP4-2在干旱和高鹽脅迫下表達量均顯著高于對照組(0 h)，但表達呈波動變化(圖6A)。

圖6 不同脅迫條件下PeTIPs的表達分析Fig.6 Expression analysis of PeTIPs under different stresses

另外，根據PeTIPs在脅迫條件下葉片中的qPCR結果，同時結合RNA-seq數據中PeTIPs的組織表達情況[17]，選取8個在根中表達的PeTIPs(PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP1-3、PeTIP2-1、PeTIP2-2、PeTIP2-3、PeTIP2-4和PeTIP4-3)，分析它們在低溫、干旱和高鹽處理后毛竹幼苗根中的表達變化。結果表明，低溫處理下，除PeTIP2-2之外，其余7個PeTIPs在處理前期(1 h或2 h) 的表達量均較低，在處理中后期(4 h或8 h) 的表達量顯著上升。干旱脅迫下的8個基因變化趨勢各異，其中PeTIP1-3的表達量隨干旱處理時間延長而增加，而PeTIP2-1表現出相反的表達趨勢；PeTIP2-2在干旱處理2 h和4 h表達量較高，而PeTIP2-3則在處理1 h和8 h的表達量較高。在高鹽處理條件下6個基因(PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP2-1、PeTIP2-2、PeTIP2-3和PeTIP2-4) 的表達量均顯著高于對照組，2個基因(PeTIP1-3和PeTIP4-3)在處理前期(1 h或2 h) 的表達量均較低，在處理中后期(4 h或8 h) 的表達量上升，與對照組(0 h) 達到差異顯著水平(圖6B)。

3 討論

與動物相比，植物具有更多的AQPs亞家族和多樣的異構體，其中有些是植物所特有的。研究表明，毛竹在進化過程中經歷了全基因組復制事件和多數基因簇的分化[16]，PeTIPs存在成員增多的現象。與其他植物相似，PeTIPs亞家族的19個成員被分為5個亞組(圖2)[4，30-31]，且所有亞組成員均含有保守的NPA基序和Froger's殘基以及差異的Ar/R選擇性過濾器 (圖1和表3)。NPA基序是運輸活動中必不可少的組成部分，在動物、植物、原生動物、真菌、真細菌和古細菌等多種MIPs中都比較保守[32-33]，而Ar/R選擇性過濾器則具有多樣性[34]，在決定底物親和性和通過生物膜的效率方面均發揮著重要作用[35]。如菠蘿Ar/R選擇性過濾器的Loop E上一個纈氨酸(V) 被丙氨酸(A) 替換后，水分運輸效率降低，但可以兼容運輸甲酰胺、尿素和甘油[14，33]。PeTIPs不同亞組間的Ar/R選擇性過濾器的多樣性預示著它們蛋白結構和功能多樣性。另外，PeTIPs亞家族Froger's位點保守的T-S-A-Y-W殘基，推測它們可能也參與尿素和H2O2的運輸[36]。

在進化過程中，多倍體化是植物適應新環境和形成新物種的重要機制[37]。TIPs是定位在液泡膜上的運輸水分效率極高的一類膜蛋白，它主要負責水和小分子物質的運輸，并參與細胞膨壓調節、信號傳導和細胞降解等過程[38]。TIPs還可以通過提高水分運輸效率從而增強植物對干旱和鹽脅迫的耐受能力[39]。通過對毛竹種內以及毛竹和水稻種間的TIPs的共線性分析發現，片段重復可能是PeTIPs數量增加的主要原因，且擴張的基因主要集中在PeTIP4s和PeTIP5s亞組(圖3)。然而，28對基因對的Ka/Ks均小于1，表明PeTIPs在擴張進化的過程中受到了純化選擇，復制產生的新基因可能還沒有形成新的功能[40-41]。影響植物基因功能的因素有很多，其中轉錄因子通過識別靶基因啟動子特定位點調控基因表達是重要機制之一[42]。在PeTIPs啟動子序列中存在多種逆境和激素相關的調控元件(圖4)，其中已證明MYB轉錄因子通過結合MBS參與干旱調節[43]，元件 AuxRR-core參與生長素響應[44]，推測PeTIPs啟動子中所含相同的調控元件可能具有類似作用。

基因的表達特征是基因功能的重要表現方式。RNA-seq結果表明，不同PeTIPs亞組在脅迫條件下的葉片中的表達模式不同，暗示著其功能的差異，其中PeTIP1s和PeTIP4s的5個基因明顯參與葉片對逆境脅迫的響應(圖5)。qPCR結果進一步證明PeTIPs在不同逆境脅迫下表達模式存在差異，同一基因在毛竹不同組織中的表達模式也不盡相同(圖6)。另外，RNA-seq和qPCR結果也存在一定差異，原因可能是二者所用材料不一致。由此表明，PeTIPs在逆境條件下功能的多樣性，而其發揮作用的機制仍需更深入研究。目前，對植物AQPs的研究大多局限于其基因組和轉錄組以及單個基因功能的鑒定，很少涉及個體表型與特定AQP異構體基因型的關聯研究[14]，這將是未來研究的重要方向。植物AQPs除了在提高水的利用率和耐旱、鹽、有毒土壤等方面具有廣泛的推廣應用前景外，在土壤和水資源的生物修復方面也有很大的潛力。此外，含有植物AQP的膜可用于各種溶質或氣體 (CO2、NH3) 的凈化，將在食品加工、改進和恢復工業正常環境中發揮重要作用[14]。因此，要發揮PeTIPs在生產生活等方面的功能，仍需開展大量的基礎性研究工作。

4 結論

在毛竹新版本基因組中共鑒定出19個PeTIPs基因，分為5個亞組，各亞組成員均具有完整的保守結構域。PeTIPs啟動子區域中含有多種參與脅迫、激素響應的調控元件，RNA-seq數據和qPCR結果證實了PeTIPs參與低溫、干旱和強光的脅迫應答，推測它們在毛竹抵御外界逆境脅迫時發揮著不同的功能。研究結果將為進一步開展毛竹基因工程研究提供候選基因資源，對培育毛竹抗逆新品種具有重要參考價值。