大豆分離蛋白基生物醫用材料的制備和應用前景分析

王瑞瑞

(青海師范大學 化學化工學院，青海 西寧 810016 )

大豆是世界上利用最為廣泛的豆類作物之一，具有營養價值高、價格低廉、來源豐富等特點。大豆分離蛋白(SPI)是一種來源于豆粕且具有較高商業價值的大豆蛋白產品。由于來源于植物體，消除了傳播疾病的風險，SPI是一種公認的安全化合物(GRAS)。隨著能源危機和環境污染的日益加劇，充分利用SPI來源豐富、生物相容、可再生、可生物降解等特點，開發性能優良、附加值高的蛋白質基生物醫用材料能夠有效減少石油衍生聚合物的使用，從而減輕環境污染。SPI基生物醫用材料的開發解決了傳統合成類高分子材料的使用安全問題，利于豆類作物的高值轉化，已成為研究熱點。

1 大豆分離蛋白的結構與性質

SPI由球蛋白(11S)和β-伴球蛋白(7S)組成。7S由三個亞基α、α′和β構成。11S是六聚體，見圖1。

圖1 球蛋白分子的結構示意圖[1]Fig.1 Schematic diagram of glycinin molecule(11S) [1]

酸性亞基A和堿性亞基B通過靜電和氫鍵連接成兩個六角形環，形成一個空心圓柱體。11S在一定的pH或受熱條件下可以分解成7S[1]。SPI中含有8種人體必需氨基酸(異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸)，能夠有效平衡機體內氨基酸的組成，膽固醇含量低，可有效降低高血壓、心腦血管疾病的患病風險[2]。與其他天然蛋白相比，SPI具有優良的膠凝、發泡、抗氧化能力和優異的生物相容性，被廣泛用于各種功能食品和包裝材料的制備[3]。近年來，人們發現SPI富含的精氨酸和谷氨酸能夠強健和修復受損基因，促進機體新陳代謝和受損細胞新生，具有較強的傷口愈合能力。同時，SPI良好的表面疏水性和優異的乳化特性[4]，可以對生物活性組分(維生素D、輔酶Q10、葉酸等)進行高效負載從而用作藥物載體材料[5]。SPI無需額外添加昂貴的生長因子就能夠促進組織細胞再生，良好的生物相容性和低免疫原性使SPI基生物功能材料的研發及在組織再生、基因傳遞等生物醫用領域的應用具有更強的吸引力。

但是，SPI分子結構中存在大量的氨基、羧基、羥基等基團，分子結構中以無規線團和α螺旋結構為主，因此，SPI基生物材料普遍存在耐濕性差、易脆裂和力學性能差等缺點[6]。這些缺陷極大地限制了SPI在生物醫用材料領域的應用。目前，為了改善SPI基生物材料的應用性能，通常采用交聯改性、共混改性等方法對SPI基生物材料進行改性處理，這些方法一定程度上改善了SPI基薄膜的使用性能，拓寬了SPI基生物材料在疏水性藥物載體和創面敷料薄膜等生物醫用材料領域的應用。

2 大豆分離蛋白基生物醫用材料制備方法

1940年，人們就開始研究大豆蛋白基功能材料，但是，SPI耐水性和穩定性較差，材料硬脆，流變阻力大[7]。而且，SPI極強的吸水性易導致微生物滋生等問題，限制了其作為生物醫用材料的開發應用。為了克服SPI固有的缺點，拓寬SPI基生物功能材料在醫用領域的應用范圍，通常需要對SPI進行改性處理。

2.1 交聯改性法

交聯改性法是豆類蛋白結構的主要修飾策略，也是開發新型SPI基生物醫用材料的主要手段[7]。同膠原蛋白一樣，物理、化學和酶促交聯改性均可以賦予SPI基蛋白材料致密的交聯網狀結構，有效提高SPI基蛋白醫用材料的機械強度。SPI可以通過熱交聯、輻照交聯、化學交聯和酶促交聯，使SPI分子結構中的—NH2、—OH、—SH等活性基團發生交聯反應。最有效的SPI交聯劑為甲醛和戊二醛，但是這兩種交聯劑改性的SPI基生物功能材料具有潛在的生理毒性，在實際應用中受到了限制。Peles等[8]研究了以乙二醛和ι-半胱氨酸為交聯劑制備SPI改性蛋白膜。結果表明,乙二醛和ι-半胱氨酸交聯改性SPI膜具有優異的機械性能和藥物緩釋性能，可以有效預防細菌感染，促進傷口愈合。這種獨特的交聯網狀結構可以用作燒傷和潰瘍創面敷料，在傷口愈合領域具有大的應用潛力。SPI還可以與金屬離子(如Ca2+)產生配位交聯，實現SPI材料的改性。Vaz等[9]研究在SPI中添加三聚磷酸鈣形成熱塑性材料，這種材料無毒，能夠促進組織細胞增殖，可以用作生物活性骨填充劑和傷口敷料[10]。交聯改性方法試圖建立交聯致密的網絡結構從而賦予SPI基蛋白材料優異的力學強度，但是這種網絡結構往往伴隨著材料延伸率的大幅度下降，導致材料的可塑性下降。此外，交聯改性過程中，交聯劑的使用所產生的細胞毒性問題一直備受爭議，也極大地限制了交聯改性SPI材料在生物醫用材料領域的應用。

2.2 共混改性法

采用一些具有獨特性能的材料對SPI進行共混改性，可以賦予SPI基蛋白材料優異的功能特性。Tansaz等[11]將納米級生物活性玻璃和SPI進行共混制備了SPI生物降解膜，研究發現制備的復合材料對血液和滲出液具有高吸附性，為細胞增殖提供了一個理想的環境，可作為新型創面止血材料。Han等[12]研究了甘草提取物(LCR)對SPI膜的改性作用。LCR的酚羥基和SPI的活性基團之間可以形成氫鍵，提高了薄膜的機械性能、阻隔(阻水、阻氧、阻光)性能和抗氧化性能。Wu等[13]在SPI成膜液中加入植物源肉桂醛和合成的氧化鋅納米片，增強了SPI膜的力學性能、屏障性能和抗真菌性能。

將天然產物的活性基團和SPI分子之間通過氫鍵等非共價鍵作用產生網狀結構，從而提高SPI基蛋白膜材料的機械強度，同時賦予材料抗氧、殺菌等功能特性，是目前的一個主要發展方向。Li等[14]研究用自愈型聚合物對SPI進行共混改性，以解決SPI基材料的不可逆損傷問題，可賦予材料智能特性。自愈性聚合物改性可以延長SPI基蛋白材料的使用壽命、提高生物安全性和降低維護成本，被廣泛應用在組織工程領域。他們研究將SPI與聚乙烯亞胺(PEI)和金屬離子Cu(II)或Zn(II)相結合，制備了具有優異自愈性和抗菌性能的高機械強度SPI基蛋白材料。PEI的鏈遷移率高，與SPI的非共價鍵結合賦予SPI基復合材料動態可逆性，即使在室溫下，這些復合材料也表現出良好的自愈能力。還可以通過改變金屬離子的含量和種類賦予SPI基復合材料可調性。此外，PEI和金屬離子具有一定的抗菌能力，克服了SPI易受微生物侵襲污染的缺點。為研制可回收和耐用性的SPI基功能材料提供了新思路。此外，光熱療法(PTT)由于其安全性和高效性，近年來已成為一種很有前途的腫瘤手術、放療、化療和生物治療的治療方法。PTT法通常使用氧化石墨烯(GO)、碳納米管、納米金粒子、近紅外(NIR)有機染料作為光吸收劑，可產生用于燒蝕腫瘤的局部高溫。在臨床應用中可以利用近紅外光輻照燒蝕目標病灶的同時，有效避免了破壞病灶附近組織。Jiang等[15]以SPI和氧化石墨烯為原料，制備了SPI/GO納米復合材料。氧化石墨烯被SPI原位還原并穩定下來，合成的SPI/rGO納米復合材料在水中具有良好的分散性和生物相容性。可以作為一種光熱劑用于癌癥治療，在抗癌藥物領域具有廣闊的應用前景。但是，共混改性法由于填料沉積速度不同極易造成分布不均等問題，此外，共混改性法生產效率偏低，制備過程容易造成材料污染，目前，這種方法僅限于實驗室研究，在大規模工業化生產方面仍然存在一定的局限性。

SPI和多糖共混可以有效保持生物活性分子的活性，為開發功能醫用保健品提供了新方向。Xing等[16]研究了SPI改性殼聚糖基薄膜的功能特性。SPI通過與活性基團(如—NH2)反應來改變SPI的分子形態，有效提高了殼聚糖基薄膜的延展性，克服了殼聚糖膜易脆和價格昂貴的缺點，成膜具有優異的抗菌性能。Han等[17]研究了由SPI、羧甲基纖維素(CMC)和兒茶素(CT)組成的復合膜材料，與純SPI膜相比，復合膜具有更好的水溶性和抗張強度，但是復合膜的透光性、水蒸氣透過率和伸長率有所下降。此外，復合膜具有一定清除自由基的能力。Deng等[18]利用熱處理工藝制備了玉米纖維膠(CFG)-大豆分離蛋白(SPI)互穿網絡水凝膠，CFG-SPI互穿網絡水凝膠具有規則、致密的內部結構和光滑的表面。與SPI水凝膠相比，CFG-SPI互穿網絡水凝膠具有更大的硬度和更好延展性。Zheng等[19]采用雙醛羧甲基纖維素(DCMC)改性SPI蛋白膜，顯著提高了薄膜的抗張強度，有效改善了SPI蛋白膜的耐水性，提高了SPI蛋白膜的熱穩定性。Pan等[20]采用熱重分析法研究了SPI-海藻酸鈉復合成膜液的相分離程度與形貌、熱力學性質、膜性能之間的相關性，為設計功能性SPI基蛋白材料提供了理論依據。目前，利用多糖共混改性制備的SPI蛋白膜材料多用于開發功能型可食包裝材料，由于無法有效地解決SPI蛋白膜材料的耐水性問題，限制了其在生物醫用領域的應用。

將兩種蛋白質共混可以有效改善SPI膠束的流變性，是目前的研究熱點。Beliciu等[21]研究了熱處理的酪蛋白-大豆蛋白復合膠束的相容性和流變性。熱處理可能引起兩種蛋白之間的相互作用，這種相互作用的強度取決于單個蛋白質的分子結構和構象。結果表明，經熱處理的酪蛋白-大豆蛋白膠束具有復雜的流變學行為。當大豆蛋白濃度超過臨界膠凝濃度時，由于溫度超過大豆蛋白的變性溫度，酪蛋白-大豆蛋白復合膠束通過二硫鍵誘導聚集和膠凝；當大豆蛋白濃度小于臨界膠凝濃度，可以得到粘度較低、儲存穩定性好的牛頓液體。熱處理的酪蛋白-大豆蛋白膠束為設計具有一定質感和口感的功能保健材料提供了技術依據。但是，利用蛋白質共混改法在SPI基生物材料制備過程由于異源蛋白質相容性差極，易產生微相分離，導致材料耐水性、機械強度、透光性等應用性能無法得到有效改善，極大地限制了SPI基蛋白材料在生物醫用材料領域的應用。

2.3 復凝聚法

SPI和離子型多糖之間不僅可以產生美拉德反應，還能產生強的靜電吸引相互作用，這為大豆分離蛋白基生物醫用材料的設計和開發提供了新思路。淀粉、纖維素、葡聚糖、殼聚糖和阿拉伯木聚糖等多糖均可以與SPI組裝改性，提高乳化性能和穩定性[4]。許多研究者研究了蛋白質和離子型多糖之間形成的凝聚物。Yuan等[22]研究用SPI和殼聚糖(CS)在pH 3.0的體系中，121 ℃加熱15 min制備了可溶性的SPI-CS凝聚物，這種凝聚物形成的主要驅動力為靜電相互吸引作用力，殼聚糖的存在有效提高了SPI在酸性體系的溶解度，賦予了材料優異的抗菌性能。Jin等[23]通過光催化制備了SPI-果膠納米粒子(SPP)，SPI和果膠在光催化下自組裝成球形納米粒子。結果表明,SPP可以作為新型的皮克林乳化劑，經SPP穩定的乳狀液具有較高的熱穩定性、良好的耐鹽性和良好的凍融穩定性。Hu等[24]選用黃原膠和角叉菜膠兩種負電荷多糖與SPI在加熱條件下自組裝制備了生物聚合物。自組裝主要的驅動力來自靜電相互吸引作用力。制備的生物聚合物可以延長其在胃液中的消化時間，可用于減肥等功能飲品的開發。復凝聚法簡單易行，是開發SPI基自組裝生物醫用材料的一種有效方法。

2.4 自組裝法

蛋白質具有高度自組裝特性，因此，通過研究SPI的自組裝行為，利用自組裝方法制備性能優異的SPI基自組裝生物醫用材料是一種安全、高效、可行的策略。Nishinari等[25]為了揭示大豆球蛋白在加熱過程中展開多肽鏈的自組裝過程，研究了β球蛋白和球蛋白在pH 7.0的熱聚集動力學，闡明了可溶性和不溶性聚集體之間的相態差異。見圖2，β球蛋白和球蛋白組裝體的粒徑均隨加熱溫度的升高而增大，β球蛋白/球蛋白組裝體的粒徑隨β球蛋白含量的增加而減小，與β球蛋白可溶性聚集體不同，球蛋白不溶性聚集體具有密度較大的核和密度較小的殼，聚集體粒徑較小。結果表明,β球蛋白終止了球蛋白不溶性團聚體的生長，這是由于β球蛋白與球蛋白中可溶性的堿性多肽相互作用，從而提高了球蛋白的溶解度。何秀婷等[26]研究了在11S和7S在不同條件下的自組裝過程，結果表明,在低pH值、低離子強度的自組裝條件下，隨著組裝體濃度的增大，大豆蛋白更易發生纖維化聚集，7S比11S更易形成纖維化聚集體。在酸性環境下，11S纖維化聚集程度越高，越有利于熱致凝膠網絡結構的形成。相同條件下，11S自組裝凝膠的結構有序性和凝膠強度均大于7S自組裝凝膠。通過對大豆分離蛋白自組裝動力學、影響因素的研究，將加深對不同條件下大豆分離蛋白結構的認知，為大豆分離蛋白基生物醫用材料的開發提供依據。

圖2 β球蛋白/球蛋白熱聚集示意圖[25]Fig.2 Schematic diagram of the thermal aggregation of β-globulin/globulin[25]

Pan等[27]采用靜電層層自組裝法將帶正電的N-(2-羥基-3-氯化三甲銨基)丙基殼聚糖(HTCC)和帶負電的SPI交替組裝在醋酸纖維素(CA)電紡纖維氈上。通過自組裝法制備的HTCC/SPI雙層納米纖維具有更加規整的三維結構，可作為生物醫用敷料和功能食品包裝材料使用。Norouzi等[28]采用SPI水凝膠對聚對苯二甲酸乙二醇酯織物(PET)進行表面改性，將丙烯酸(AA)接枝聚合在PET織物表面，用碳二亞胺(EDAC)活化丙烯酸酯結構中的羧基，在PET織物表面涂覆SPI。PET織物作為基材對SPI水凝膠起支撐保護作用，有效改善了SPI水凝膠的機械強度。可用于制備新型創面敷料，還可以負載加巴噴丁用于糖尿病潰瘍的治療。

Chen等[29]研究了體系溫度、pH值、蛋白質濃度對SPI自組裝過程的影響。見圖3，在室溫下，SPI分子自組裝形成的粒子尺寸隨著pH值的降低而增加。隨著溫度的升高，SPI自聚體發生部分分解。當溫度進一步升高，SPI分子發生變性，從而形成更大的聚集體，進而形成凝膠。Chen等[30]還研究了NaCl濃度對大豆蛋白分子自聚的影響。結果表明,在一定溫度下，凝膠速率隨離子強度、蛋白質濃度和聚集體粒徑的增加而顯著提高。凝膠硬度不受聚集體大小和離子強度的影響，但隨著蛋白質濃度的增加而顯著增加。與熱誘導的天然大豆蛋白凝膠相比，NaCl誘導SPI自聚體的凝膠速度更快，并且可以在較低的蛋白濃度和溫度下發生。天然大豆蛋白熱凝膠和鹽誘導凝膠的硬度無明顯差異，但是，后者的活化能更小，結構更均勻。張娜等[31]研究了不同pH值條件下制備了大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽自組裝產物。利用熒光光譜對自組裝產物的抗氧化性能進行了分析。結果表明,隨著體系pH值的變化，處于極性環境中的色氨酸殘基逐漸向大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽組裝產物分子內部的非極性環境中轉移，伴隨著熒光強度的變化，自組裝產物的抗氧化能力較高，在pH 6.0時達到最大。Zhang等[32]首次通過超聲誘導的分子自組裝成功制備了雙功能大豆肽納米顆粒(SPN)，該顆粒來源于水解過程中形成了大的不溶性肽聚集物。SPN呈球形，粒徑小、分布均勻。SPN能夠有效覆蓋在油水界面，使乳液具有良好的抗聚結穩定性。SPN對脂質氧化具有較好的抑制作用，可以作為一種新型的雙功能乳化劑。Li等[33]以過硫酸銨為引發劑、巰基乙酸作為蛋白質變性劑合成熱響應性接枝共聚物[SPI-g-poly(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPA)]，研究了其在水溶液中的自組裝行為。SPI-g-PNIPA接枝共聚物的形態與體系濃度、溫度、pH值、離子強度有關，表現出簡單的球形結構、球形核殼結構和隨機的線圈結構。近年來，球狀蛋白(大豆蛋白、乳清蛋白、牛血清蛋白和卵清蛋白等)的自組裝研究在生物醫學領域和功能食品領域已成為研究熱點[34]。

2.5 熔融鑄造法

目前，熔融鑄造法是SPI基蛋白材料工業化生產的主要方法。該方法包括擠壓、熱壓和注塑三個階段。在高溫、高壓和化學剪切力的作用下，SPI發生變性，溶解度降低，轉化為連續的塑性熔體，然后通過模具塑化形成連續的型材。熔融鑄造法可以獲得強度較大的SPI基材料，但是通常需要加入大量小分子的增塑劑(多元醇、酰胺、羥胺等)提高SPI的可塑性[35]。由于大量小分子增塑劑的使用會導致SPI基蛋白材料的耐水性和透光性變差，而且熔融鑄造法需要的設備投資成本大、能耗高，經濟收益低。

3 大豆分離蛋白基生物醫用材料的發展前景

大豆分離蛋白(SPI)價廉易得、來源廣泛，具有優異的生物相容性和良好的生物降解性等特點，是集富集、緩釋和靶向于一體的理想載體，開發以SPI為基材的天然高分子多功能納米載藥體系能夠有效提高疏水性藥物的溶解度，控制藥物釋放率和提高藥物的生物利用率，在藥物輸送和制藥領域具有廣闊的應用前景。此外，SPI基醫用敷料具有較強的保水性、一定的結構靈活性和合適的機械性能、透氣性能和抗感染性能，并且具有優異的生物相容性，能夠保持創面的濕潤環境、防止繼發性損傷、為細胞遷移和感染清除提供微環境，是制備創面敷料的理想材料。今后的研究應致力于研發操作簡便、成本較低并且對環境無毒無害的SPI基生物醫用材料制備方法，在賦予其優異性能的同時有效改善SPI基生物醫用材料的耐水性、可塑性和穩定性。