延薯4 號馬鈴薯對氮素的生理生化響應及轉錄組分析

（吉林農業大學園藝學院，吉林 長春 130118）

【研究意義】馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是一種重要的糧食和蔬菜作物，氮對其生長發育具有重要意義。氮是作物生長發育所必需的重要元素，銨鹽和硝酸鹽是作物氮素吸收的主要來源。氮肥可顯著影響馬鈴薯產量，氮素缺乏限制了馬鈴薯的生長［1］，適宜的氮肥可有效提高收益率［2］，過量的氮肥反而降低了經濟和生態效益。因此，明確延薯4 號馬鈴薯受氮素影響的生理生化變化以及氮代謝相關基因的表達情況，為其他馬鈴薯品種相關內容研究以及培育優質品種提供參考價值。【前人研究進展】氮肥嚴重影響作物生理生化響應，可溶性糖可為植物生長發育提供足夠能量，同時也是植物體生理代謝的中間產物，通過代謝途徑合成其他物質（如蛋白質等），是調節植物體生殖生長與基因表達的作用因子。可溶性蛋白作為植物體重要的生理指標，參與了多項生長過程中的物質代謝活動，是植物體內氮素的主要存在方式，根的生長情況和活力水平直接影響植物的營養狀況以及產量水平，硝酸還原酶（NR）與作物吸收利用的氮素含量有關，施氮可顯著提升作物的活性。谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內氨同化關鍵酶，是氮代謝的中心樞紐，從外界吸收的硝態氮、銨態氮，以及固氮和氨釋放均需要經過GS 的反應途徑。然而氮肥對作物產量的影響遠遠小于作物氮素效率的影響，培育氮素高效新品種是降低成本、減少環境污染、提高作物產量的有效途徑。氮代謝是植物重要的生理過程之一，是決定氮效率高低的重要生理代謝過程。作物通過硝酸鹽轉運蛋白從外部吸收氮，經硝酸鹽和亞硝酸鹽轉運蛋白轉化為銨鹽，GS 和谷氨酸合成酶（Glutamate synthase,GOGAT）將轉運蛋白轉化為必需的氨基酸或蛋白質，谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase,GdH）對銨鹽和谷氨酸有調節作用，這便是作物吸收氮素并進行同化利用的過程。【本研究切入點】近年來，對作物氮素脅迫的研究成為一個熱點。對于小麥［3］、玉米［4］、高粱［5］、水稻［6］等作物在氮素脅迫下的差異表達早有研究，而對于馬鈴薯受氮素影響的關鍵生長發育時期以及此時期氮代謝基因的表達差異尚不明確。【擬解決的關鍵問題】延薯4 號為馬鈴薯中晚熟品種，生長勢強，根系發達，受氮素的影響較為明顯，是氮高效品種，為了確定不同氮水平處理下馬鈴薯氮效率差異的生理生化響應以及氮代謝差異基因，我們以延薯4 號馬鈴薯作為試驗材料，我們對馬鈴薯在施氮處理和未氮處理下的產量、含氮量、氮效率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力、NRA，GS 活性進行測定，發現現蕾期為馬鈴薯生長發育過程中受到氮素影響最明顯的時期，進而對馬鈴薯現蕾期的葉片和根進行轉錄組測序分析，確定了參與馬鈴薯氮代謝的相關基因以及表達水平的差異，研究結果為進一步研究氮素轉運機理以及培育氮素高效品種提供了重要資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種為延薯4號，供試肥料為尿素（N≥46%）、過磷酸鈣（P2O5≥18%）、硫酸鉀（K2O≥50%）；供試盆規格為盆底內徑22 cm，高25 cm，盆口內徑 30 cm；土壤為含氮量1.56 g/kg的田園土，過篩、風干后每盆裝8 kg。

1.2 試驗方法

試驗在吉林農業大學蔬菜基地進行。2017年4月25日，采用隨機區組的方式將種薯進行盆栽種植，種植深度6～8 cm，設置施氮（N、P、K）和不施氮（P、K）2個處理，每667 m2施肥量為純N 22 kg、純P 12 kg、純K 18 kg，均一次性作底肥施入，每個處理30盆，共60盆。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 馬鈴薯生理生化分析 在馬鈴薯整個生育期（苗期，現蕾期，塊莖膨大期，淀粉積累期，成熟期），使用蒽酮法測量葉片可溶性糖含量，使用考馬斯亮藍G-250 法測定葉片可溶性蛋白含量，使用TTC 法測量根系活力，采用活體法測定葉片NR 活性［7］，根據田洵試驗方法測量葉片GS 活性［8］。在馬鈴薯成熟期選取3 株長勢一致的馬鈴薯整株，使用電子秤測量薯塊重量；使用烘干箱將葉、莖、根在105 ℃下殺青30 min，85℃烘干至恒重，使用電子天平測量干重；使用粉碎機分別粉碎馬鈴薯葉、莖、根干樣過0.150 mm篩，土壤經烘干后過0.150 mm 篩，使用開氏消煮法消煮樣品，使用全自動凱氏定氮儀測量含氮量。

氮效率（NUE）=植株成熟期產量/土壤供氮量

氮吸收效率（UPE）=植株含氮總量/土壤供氮量

氮利用效率（UTE）=植株成熟期產量/植株含氮總量

1.3.2 馬鈴薯轉錄組分析 在馬鈴薯現蕾期采集新鮮的葉和根組織，用DEPC 水反復沖洗，選取≥500 mg 的葉片（頂部開始第二葉）和根，用濾紙吸干水分后存放于2 mL 凍存管中，經液氮處理后-80 ℃冰箱保存，隨后送至Novogene 公司進行轉錄組測序。

用Trizol 總RNA 提取試劑盒分離各樣品的總RNA。RNA 質量的初步檢測采用瓊脂糖凝膠電泳，使用Nanodrop 檢測RNA 純度（OD260/280比值），使用Qubit 對RNA 濃度進行精確定量，使用Agilent 2000 精確檢測RNA 的完整性；同時，計算Q20、Q30 和GC 含量。采用FPKM 計算方法，使用HTSeq 軟件對樣品進行基因表達水平分析［9］，使用DESeq R 包對差異表達基因進行識別［10］，使用GOseq 軟件進行GO 富集分析［11］，使用KOBAS（2.0）軟件［12］進行Pathway 富集分析，使用HemI 軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯產量及氮效率差異

由表1 可知，馬鈴薯的含氮量以及氮效率受不同氮濃度影響。在施氮處理下，葉、莖、根的含氮量明顯高于不施氮處理，分別為1.39 倍、1.29倍、1.25 倍，總氮含量為1.32 倍。在施氮處理下，產量增加13.89%，氮吸收效率增加19.57%，氮利用效率降低15.78%，氮效率增加3.96%。

2.2 馬鈴薯生理生化差異

由圖1 可知，馬鈴薯可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力、硝酸還原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性受不同氮濃度影響。在兩種處理下，可溶性糖含量（圖1A）、根系活力（圖1C）、NRA（圖1D）、GS 活性（圖1E）均呈單峰曲線變化；可溶性蛋白含量（圖1B）在施氮處理下表現為雙峰曲線變化，在未施氮處理下呈現下降趨勢。同時，由于這5 個指標均在現蕾期出現了轉折性變化，本試驗以部分指標與馬鈴薯塊莖之間進行通徑分析，馬鈴薯塊莖產量與成熟期的氮吸收效率和氮利用效率、現蕾期的可溶性糖含量和可溶性蛋白含量、現蕾期的NRA 和GS 活性呈顯著正相關，相關系數分別為0.9692、0.8598 和0.9396，決定系數分別為0.9394、0.7393 和0.7049，直接通徑系數分別為1.0356、0.4819、0.1698、0.7495、0.2452 和0.9031。通徑分析表明，塊莖產量與馬鈴薯成熟期的氮吸收效率和氮利用效率呈顯著正相關（圖2A），與馬鈴薯現蕾期的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、NRA 和GS 活性呈顯著正相關（圖2B、C）。

表1 馬鈴薯產量及氮效率Table 1 Potato yield and nitrogen efficiency

圖1 氮素對馬鈴薯生理生化的影響Fig.1 Effects of nitrogen on physiology and biochemistry of potato

2.3 馬鈴薯轉錄組數據質量

轉錄組測序分析了馬鈴薯在施氮和未施氮處理的葉和根，獲得12 個RNA-seq 文庫，利用Illumina/HiSeq TM 2000 RNA 測序平臺對其中的RNA-seq 文庫進行測序。轉錄組測序通過對raw reads 進行過濾得到clean reads，占樣品總讀數的92%以上，共產生約5721 萬個raw reads 以及約5402 萬個clean reads，clean bases 在6.75 G 左右，Q20 和Q30 的百分比分別超過97%和92%，GC含量超過40%（表2），表明轉錄組測序數據可靠，可進行下一步的分析。

2.4 馬鈴薯基因差異表達分析

由圖3 可知，馬鈴薯在施氮處理和不施氮處理下葉和根中均存在大量差異基因。施氮處理的馬鈴薯葉片中共有1446 個差異顯著基因，其中463 個上調基因，983 個下調基因；根中共有1009 個差異顯著基因，其中493 個上調基因、516 個下調基因。施氮處理的馬鈴薯葉片和根中共有12996 個差異顯著基因，其中6440 個上調基因、6556 個下調基因；不施氮處理的馬鈴薯葉片和根中共有12178 個差異顯著基因，其中6268 個上調基因、5910 個下調基因。表明氮素對馬鈴薯基因的表達水平有一定影響。

圖3 馬鈴薯葉片和根中差異表達基因分析Fig.3 Analysis of differentially expressed genes in potato leaves and roots

馬鈴薯氮代謝途徑分析表明，植物通過NRT轉運蛋白基因從外界吸收氮素，利用硝酸還原酶將硝酸鹽轉化成亞硝酸鹽，隨后經過亞硝酸還原酶轉化成銨態氮，或者直接通過硝酸還原酶轉換成銨態氮。銨態氮可通過GS/GOGAT 循環途徑合成谷氨酸供植物吸收，GdH 通過α-酮戊二酸和NH4+轉化成谷氨酸，同時在銨態氮不足時可釋放NH4+用以植物體生命活動（圖4）。

圖4 馬鈴薯氮代謝熱圖和通路分析Fig.4 Nitrogen metabolism heat map and pathway analysis of potato

對馬鈴薯施氮與不施氮處理下葉片和根中氮代謝差異基因進行聚類分析（圖4），馬鈴薯葉片中差異基因聚為一類，根中差異基因聚為一類。同時19 個差異基因在不同類別中存在顯著性差異。由表3 可知，在不同處理下馬鈴薯葉片和根中均僅有1 個下調表達基因。在施氮處理下馬鈴薯葉片和根中共有15 個差異基因，其中8 個上調表達基因，7 個下調表達基因；在不施氮處理下葉片和根中共有19 個差異基因，其中8 個上調表達基因，11 個下調表達基因。研究發現，在兩種處理下，有7 個差異基因在葉片中的表達量均高于根，分別為PGSC0003DMG400016996、PGSC0003DMG400006913、PGSC0003DMG400030212、PGSC0003DMG400025823、PGSC0003DMG400016001、PGSC0003DMG400004355、PGSC0003DMG400009698；同時，有7個差異基因均在根中的表達量高于葉片，分別為PGSC0003DMG400015734、PGSC0003DMG400001145、PGSC0003DMG400008262、PGSC0003DMG400008356、PGSC0003DMG400014592、PGSC0003DMG400013235、Novel02273。

3 討論

氮是馬鈴薯生長發育中重要的營養元素，在生物體代謝和生化過程中起著關鍵作用。較低水平的氮肥會顯著抑制馬鈴薯的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力、NRA、GS 活性，降低馬鈴薯各部位的含氮量以及氮效率。Illumina Hiseq 2000 測序現已成為植物轉錄組測序的一種有效手段，本試驗表明現蕾期為馬鈴薯生長發育關鍵時期，進而對馬鈴薯現蕾期葉片和根進行轉錄組測序，探究馬鈴薯在施氮和不施氮下葉和根中氮代謝基因表達的差異。

3.1 馬鈴薯生理生化差異分析

可溶性糖在植物的整個生長過程中占有重要的位置，可以為植物的生長發育提供足夠的能量，同時也是植物體生理代謝的中間產物，是調節植物體生殖生長與基因表達的作用因子，其活性的高低直接影響到植物的氮代謝能力［13］。可溶性蛋白作為植物體重要的生理指標，參與了多項生長過程中的物質代謝活動，是植物體內氮素的主要存在方式，是限制馬鈴薯生長發育以及產量形成的主要因素之一。氮處理可顯著增加葉片中可溶性糖和可溶性蛋白含量，在甜菜［14］、冬小麥［15］、馬鈴薯［16］等作物中均有所體現，與本試驗結果一致。根系是植物最活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響植物的營養狀況以及產量水平。根系的發育與氮素吸收效率密切相關，而根系活力的強弱對氮素高效吸收有顯著影響［17］，高氮使馬鈴薯根系活力增加，且產量有所提升。NR 是植物氮代謝途徑中的一種限速酶，也是高等植物中氮同化的誘導酶或適應酶，催化了植物硝酸鹽-亞硝酸鹽的還原過程，也就是將吸收的簡單無機物在體內轉換成復雜的有機物供植物吸收利用。研究發現，施用氮肥可明顯提高馬鈴薯葉片的NRA，后期活性逐漸下降［18］，同時氮素越高GS 活性越強，并且提高氮利用效率［19］，與本試驗結果一致。同時本試驗表明施氮處理可顯著增加馬鈴薯各部位含氮量、氮效率以及產量，并且可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力、NRA、GS 活性均在現蕾期發生明顯的轉折性變化，通徑分析表明，塊莖產量與氮吸收效率和氮利用效率呈顯著正相關，與現蕾期可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、NRA、GS 活性呈顯著正相關。

綜上所述，施氮處理可顯著提高延薯4 號馬鈴薯各項生理生化指標，同時現蕾期為馬鈴薯生長發育關鍵時期。由此本試驗以現蕾期的葉片和根進行轉錄組測序分析，尋找其氮代謝基因的差異表達水平，從分子生物學角度闡明延薯4 號馬鈴薯對氮素的響應差異。

3.2 馬鈴薯差異表達基因分析

本試驗選取馬鈴薯在施氮和不施氮處理下現蕾期的葉片和根進行轉錄組測序分析，獲得12 個RNA-seq 文庫，利用Illumina/HiSeq TM 2000 測序平臺對其中的RNA-seq 文庫進行測序。施氮處理下葉片和根中共有12996 個差異表達基因，其中6440 個上調基因，6556 個下調基因，通過KEGG 途徑共鑒別出15 個氮代謝差異基因，其中8 個基因在葉片中表達量較高，7 個基因在根中表達量較高。不施氮處理下葉片和根中共有12178 個差異表達基因，其中6268 個上調基因，5910個下調基因，通過KEGG途徑共鑒別出19個氮代謝差異基因，其中8個基因在葉片中表達量較高，11個基因在根中表達量較高。在相同處理下馬鈴薯葉片和根中共鑒別出19個氮代謝差異表達基因，其中7個基因在葉片中表達量較高，分別為PGSC0003DMG400016996（NRT2.5）、PGSC0003DMG400006913（NRT2.7）、PGSC0003DMG400030212（NR）、PGSC0003DMG400025823（NiR）、PGSC0003DMG400016001（GdH）、PGSC0003DMG400004355（GS）、PGSC0003DMG400009698（Fd-GOGAT）；同時，有7個差異基因均在根中表達量較高，分別為PGSC0003DMG400015734（NRT2.4）、PGSC0003DMG400001145（NRT2.4）、PGSC0003DMG400008262（NiR）、PGSC0003DMG400008356（GdH）、PGSC0003DMG400014592（GS）、PGSC0003DMG400013235（GS）、Novel02273（NADH-GOGAT）。

在一定的氮濃度范圍內，NRT 2.4促進了作物對氮的吸收，同時在低氮條件下仍能提供植物所需的養分［20］，NRT2.4在根表皮細胞中進行高親和性NO3-N 轉運［21］，本試驗表明NRT2.4基因在根中的表達量高于葉片，結果一致。在低硝酸鹽的情況下，NRT 2.5可以促進植物體內硝酸鹽的流動，表明NRT 2.5在低氮條件下表達量較高，在過量氮濃度條件下表達量受到抑制［22］，并且NRT2.5在不依賴NO3-N 攝取的植物中起作用，而在植物NO3-N 的分布中不起作用，優先在葉中表達的NRT2.5基因在植物生長中起到促進作用［23］。唐賢禮等［24］發現，PtNRT2.7基因主要在葉片中表達，并且在成熟葉片中表達量最高，可受NO3-N 的誘導并增強作物根系的生長。本試驗得出相似結論，即NRT2.5、NRT2.7基因在葉中表達量高于根。當外界硝酸鹽含量過高時，NR、NiR停止工作，導致硝酸鹽、亞硝酸鹽大量累積。NRA 隨著施氮水平的增加，其活性會有所升高，適量増施氮肥能有效提高作物器官的NRA，但在氮含量達到一定程度時，NRA 將會下降［25］。杜永成等［26］研究表明，増施一定量的氮肥，NR 及NiR 活性均有一定的提升，且呈現雙峰曲線的變化。本試驗表明，NR基因主要在葉片中表達，而NiR基因在葉片和根中均有所表達。NH4+經過GS/GOGAT 作用下轉變為有機態氮，是氮同化吸收的主要過程。李楚曦［27］研究表明，GS基因過表達可以提高玉米對低氮條件脅迫的適應能力。Glu+NH4++ATP → Gln+ADP+Pi 硝態氮與銨態氮都能誘導GS 表達，即吸收的氮含量越高，GS 活性越高。在低氮、中氮、高氮下大麥GS 活性有所變化，呈現出氮素越高GS 活性越強的現象［28］。利用NO3-N、NH4+-N、混合氮對大豆誘導，隨著氮含量不同程度的增加，GS 活性也相對增加，表明GS 與植株氮效率的吸收利用有重要作用［29］。余佳玲等［30］研究表明，在氮素供應不足時，植物體內GOGAT 對氮素的積累以及分配、利用等方面發揮的作用較GS 要高。GOGAT 活性隨氮素水平的增加而增加，可作為氮高效品種篩選的一項指標［31］。GdH 在植株受到脅迫時發揮著重要作用，當植株缺乏氮素時，也可作用于谷氨酸使其氧化并釋放出NH4+［32］。GdH 在外界NH4+-N增加時，GdH 活性有所提升，而在外界NO3-N 濃度逐步增加的條件下，GdH 活性受到短期抑制之后活性有所增加，此時的NO3-N 轉變成NH4+-N使得植株GdH 活性發生變化［33］。GdH 主要分為NADH-GdH 與NAD+-GdH，趙雙雙等［34］研究表明，當外界氮源充足時，植株NADH 型GdH 活性下降，NAD+型GdH 活性上升，而在氮源不足時，NADH 與NAD+型GdH 活性明顯下調，實現對N的吸收利用。本試驗表明，GS和GdH基因在葉片和根中均有所表達，而Fd-GOGAT主要在葉中表達，NADH-GOGAT主要在根中表達。

4 結論

本研究對施氮和不施氮處理下延薯4號馬鈴薯現蕾期葉和根進行轉錄組測序分析，氮代謝途徑中鑒定出編碼9種基因的19個DEGs，其中PGSC0003DMG400016996（NRT2.5）、PGSC0003DMG400006913（NRT2.7）、PGSC0003DMG400030212（NR）、PGSC0003DMG400025823（NiR）、PGSC0003DMG400016001（GdH）、PGSC0003DMG400004355（GS）、PGSC0003DMG400009698（Fd-GOGAT）等7個DEGs在葉片中的表達量較高，PGSC0003DMG400015734（NRT2.4）、PGSC0003DMG400001145（NRT2.4）、PGSC0003DMG400008262（NiR）、PGSC0003DMG400008356（GdH）、PGSC0003DMG400014592（GS）、PGSC0003DMG400013235（GS）、Novel02273（NADH-GOGAT）等7個DEGs在根中的表達量較高。本研究結果表明，NRT2.4、NRT2.5、NRT2.7、NR、NiR基因主要參與馬鈴薯氮素吸收功能，GdH、GS、GOGAT基因主要參與馬鈴薯氮素利用功能，這些基因的表達提高了馬鈴薯氮效率、產量，增加了植株各部位氮含量，同時使得馬鈴薯可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、根系活力、NRA、GS活性提高，能夠進行更好的生長發育。因此了解氮高效馬鈴薯延薯4號的氮素作用機理以及氮代謝基因表達情況，將會為今后馬鈴薯氮高效品種的培育以及相關作物氮效率的研究提供理論依據。