荔枝葉片胚性愈傷組織誘導及其繼代增殖研究

（廣東省農業科學院果樹研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】荔枝（Litchi chinensisSonn.）原產于中國，迄今已有2000 多年的栽培歷史，是熱帶及亞熱帶地區的重要經濟作物。我國擁有世界上最豐富的荔枝種質資源，但由于童期長、多年生、高度雜合等因素的影響，加上荔枝遺傳背景研究資料的缺乏，導致荔枝常規育種的進程被限制。荔枝組織培養技術自20 世紀80 年代建立以來，已見花藥［1］、幼胚［2］、莖段［3］、原生質體［4］、胚性愈傷組織遺傳轉化［5］以及胚性細胞懸浮物［6］等作為外植體進行荔枝再生體系研究的報道，這為荔枝遺傳轉化技術育種提供了基礎。【前人研究進展】植物中可誘導出胚性愈傷組織的外植體種類很多，分化程度較低的外植體在植物生長調節劑作用下容易誘導出胚性愈傷組織，如玉米（Zea maysL.）的幼胚［7］、苜蓿（Medicago sativaL.）的子葉和下胚軸［8］等；而分化程度較高的外植體較難誘導，需進行特殊處理，如需光照條件的刺楸（Kalopanax septemlobusT.）葉片［9］,需0.5 mg/L TDZ 和2.0 mg/L 2,4-D 配合處理的朱頂紅（Hippeastrum vittatumL.）花梗［10］等。研究表明，荔枝組織培養最早是選用花藥［1］作為外植體，該方法具有胚性高、誘導率高等優點，但取材困難且受花期限制；花藥誘導出的胚性愈傷組織染色體變異頻率較幼胚來源的胚性愈傷組織高［11］；通過花藥獲得純合的單倍體再生荔枝植株極其困難［12］。幼胚作為外植體也受取材困難和操作難度高等因素影響。莖段取材方便，但胚性低、僅能誘導出愈傷組織［3］。研究發現，外源生長素和細胞分裂素的合理搭配在巴西香蕉［13］、番木瓜［14］和小果野蕉［15］胚性愈傷組織的誘導中起決定性作用，2,4-D 對胚性愈傷組織的誘導影響顯著，單一添加2,4-D 或搭配其他激素對胚性愈傷組織的誘導有促進作用。另外，添加劑在胚性愈傷組織的誘導與增殖中也有廣泛應用，如青海云杉（Picea crassifoliaK.）愈傷組織增殖過程中添加水解酪蛋白、谷氨酰胺和Phytagel 凝膠［16］，金煌芒果（Mangifera indicaL.）胚性愈傷組織誘導中添加椰子水、谷氨酰胺和活性炭（AC）［17］，杉木胚性愈傷組織誘導中添加茉莉酸甲酯（MeJA）［18］。添加劑在一定程度上可減少組織褐化、促進愈傷組織形成和體胚發生等［19］。胚性愈傷組織在激素條件下長期繼代培養，其生長速率逐漸降低、生長狀態下降，最終失去胚性成為非胚性組織塊［20］。謝玉明等［21］研究表明，除去或降低生長素濃度，利于荔枝胚性愈傷組織的增殖和體細胞胚的發生。【本研究切入點】目前關于荔枝胚性愈傷組織誘導及分化研究所選用的材料主要集中在幼胚和花藥，但其花期短、取材困難。葉片作為外植體材料來源較廣、取材方便、操作簡單，可以保持原有品種的優良性狀，其應用更為廣泛［19］。【擬解決的關鍵問題】本研究選取荔枝早、中、晚熟幾個代表性品種，以無菌苗葉片為外植體進行胚性愈傷組織誘導，設計3 種不同繼代培養基及培養方式進行繼代增殖試驗，對影響葉片胚性愈傷組織誘導及增殖的植物生長調節劑、基因型和接種方式的若干因素進行研究，以期為建立高效的荔枝葉片離體再生體系提供理論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為御金球成年樹體葉片，以及早熟品種三月紅和妃子笑、中熟品種桂味和糯米糍、晚熟品種御金球的無菌苗葉片。所有品種葉片和果實均采自廣東省農業科學院果樹研究所果園，無菌苗葉片由該所荔枝栽培與生理研究室培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體選取與消毒 荔枝葉片的取材時間為2018 年4－6 月晴天上午9：00－10：00，取御金球樹體上新抽生1、2、4 周的葉片，放入冰盒中帶回實驗室。將葉片置于流水中緩慢沖洗10～30 min 后，用蒸餾水潤洗1 次。在超凈工作臺上，將葉片用5% Sanosil 消毒液浸泡消毒5 min，無菌水漂洗1 次；1%多菌靈溶液浸泡消毒5 min，無菌水漂洗3 次。

1.2.2 無菌苗培養 取花后10～11 周成熟果，將果實的果皮、果肉及白色軟組織剔除并清洗干凈，將清洗后的種子置于超凈工作臺，用5%Sanosil 消毒液浸泡消毒10 min，無菌水漂洗1次；1%多菌靈溶液浸泡消毒5 min，無菌水漂洗1 次；70%酒精浸泡20～30 s，無菌水漂洗1 次；再放入0.5%升汞溶液中浸泡滅菌10 min，最后用無菌水漂洗3 次。將種子水平接種于WPM 粉（Woody Plant Medium，木本植物用培養基）+Ca（NO3）20.56 g/L+BAP（6-Benzylaminopurine）11 μmol+Kn（Kinetin）2.3 μmol+GA30.6 μmol+蔗 糖30 g/L+CH（Casein hydrolysate）400 mg/L+15% CW（Coconut water）+瓊脂6 g/L 培養基上，置于光照強度1500～2000 lx、溫度25（±1）℃、16 h 光照/8 h 黑暗培養條件下培養30 d。

1.2.3 葉片胚性愈傷組織誘導 分別以植物生長調節劑和防褐化劑為影響因子進行單因素試驗：（1）以MS 為基礎培養基，設2,4-D、NAA、KT 3 種植物生長調節劑組合，同時添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、肌醇100 mg/L，探討植物生長調節劑對御金球葉片胚性愈傷組織誘導的影響；（2）選取聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸（Vc）和活性炭（AC）為防褐化劑，每種防褐化劑設100、500、1000 mg/L 3 個濃度梯度，以不添加防褐化劑作為對照，以期篩選防褐化效果最佳的添加劑及其濃度。每個處理3 次重復，每個重復接種10 瓶，每瓶接種外植體6 枚左右。

選擇健康生長的培養20 d 的三月紅、桂味、糯米糍、妃子笑、御金球的無菌苗，以完全展開的葉片作為外植體，接種于誘導培養基上。將御金球成年樹體上新抽生1、2、4 周的葉片與1、2、4 周的無菌苗葉片（時間均以葉片完全伸展后開始計算）接種于誘導培養基上，取材樣品見圖1。同樣地，將御金球葉片切割成1 cm2大小，然后以正面朝上、正面朝下、沿主葉脈垂直方向切兩道傷口的前提下葉片正面朝上和正面朝下4 種方式接種于誘導培養基上，誘導培養基為以上單因素試驗探索出的最適培養基，探討基因型、外植體來源及時期、不同接種方式對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導的影響。每個處理3 次重復，每個重復接種10 瓶，每瓶接種外植體6 枚左右。

圖1 不同來源及時期的荔枝葉片Fig.1 Litchi leaves from different sources and stages

1.2.4 胚性愈傷組織繼代增殖培養 以御金球品種誘導出的葉片胚性愈傷組織為試驗材料，選取外觀黃色或淡黃色、長勢較快的胚性愈傷組織轉接到含有不同濃度植物生長調節劑組合的培養基上。基礎培養基為MS，均添加有蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、PVP 500 mg/L，設計NAA 和6-BA 兩個單因素，濃度均為0.5 mg/L 和2.0 mg/L，以不添加任何植物生長調節劑為對照。

設計3種不同繼代培養基及繼代方式對胚性愈傷組織進行繼代培養，以研究不同繼代方式對胚性愈傷組織繼代增殖的影響。3種繼代培養基分別為：MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP 500 mg/L（J1）、MS+2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP 500 mg/L（J2）、植物生長調節劑減半的J2培養基并添加2.0 mg/L AgNO3（J3）。3種繼代方式分別為：（1）只用J2培養基進行胚性愈傷組織繼代；（2）J1和J2培養基交替繼代；（3）J2和J3培養基交替繼代。每瓶培養基接種量大致相同，接種完后記錄其鮮重。每個處理3次重復，每個重復接種10瓶。

1.2.5 培養條件 愈傷組織/胚性愈傷組織誘導的條件為黑暗培養、溫度25（±1）℃，繼代2 次（培養基不變），繼代周期為20 d，培養60 d 后統計褐化率和誘導率。繼代培養條件為黑暗培養、溫度25（±1）℃，培養30 d 后統計增殖率。胚性愈傷組織的判斷方法為：黃色或淡黃色，結構疏松，無明顯褐化且直徑大于0.5 cm 的愈傷組織。

1.3 數據統計

試驗數據采用SPSS 19.0 進行變量分析，采用Duncan's進行差異顯著性測驗。參數計算方法如下：

愈傷組織誘導率（%）=產生愈傷組織數/外植體總數（污染除外）×100

胚性愈傷組織誘導率（%）=產生胚性愈傷組織數/外植體總數（污染除外）×100

褐化率（%）=褐化的外植體數/外植體總數（污染除外）×100

增殖率（%）=30 d 后胚性愈傷的鮮重/接種時胚性愈傷鮮重×100

2 結果與分析

2.1 不同培養基成分對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導的影響

2.1.1 植物生長調節劑對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導的影響 從表1 可以看出，2,4-D 對荔枝葉片胚性愈傷組織的誘導影響顯著，未添加2,4-D的對照和高濃度（10.0 mg/L）2,4-D 處理均難以誘導出胚性愈傷組織，1.5 mg/L 2,4-D 處理誘導率相對較高，為御金球葉片胚性愈傷組織誘導的最佳濃度。未添加任何植物生長調節劑的對照誘導率為0，其葉片材料在初期可誘導出愈傷組織，但幾乎為結構致密、顏色整體偏綠并帶有白點的塊狀組織，在后續的繼代過程中未能轉為胚性愈傷組織。在培養基中添加有2,4-D 的條件下，低劑量NAA 對葉片胚性愈傷的影響不顯著，高劑量（2.0 mg/L）NAA 反而產生抑制作用；相比于單獨添加2,4-D，附加2.0 mg/L KT 對胚性愈傷的誘導有促進作用，其誘導率最高為46.25%。由此可知，本試驗中最適植物生長調節劑組合為2,4-D 1.5 mg/L+KT 2.0 mg/L。

表1 植物生長調節劑對御金球葉片胚性愈傷組織誘導的影響Table 1 Effects of plant growth regulators on the induction of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

2.1.2 防褐化劑對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導的影響 表2 顯示，3 種防褐化劑處理后荔枝葉片褐化率均低于對照，說明外加防褐化劑PVP、Vc、AC 均能在一定程度上抑制外植體褐化。不同防褐化劑效果有顯著差異，其中AC 的防褐化效果最好、1000 mg/L AC 褐化率最低為22.64%，Vc 的防褐化效果最差，不同濃度PVP 和Vc 的防褐化效果無顯著差異。從誘導率來看，低濃度（100 mg/L）PVP 和Vc 與對照組之間沒有顯著差異，不同濃度的Vc 對誘導率的影響也無顯著差異。而不同濃度PVP 和AC 對誘導率的影響顯著，其中PVP 濃度為500 mg/L 時誘導率最高、為45.28%，AC 濃度為1000 mg/L 時誘導率最低、僅4.65%。

表2 防褐化劑對御金球葉片胚性愈傷組織誘導的影響Table 2 Effects of different anti-browning agents on the induction of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

2.2 不同基因型對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導的影響

以5 個品種荔枝的無菌苗葉片為試驗材料，培養20 d 后5 個品種外植體均能誘導出愈傷組織，其中三月紅和御金球的誘導效果較好，前者誘導率最高為85.83%；另外3 個品種誘導率較低，最難誘導出愈傷組織的品種為桂味，誘導率僅8.62%（表3）。培養60 d 后，三月紅和御金球能誘導出狀態較好且可用于后續試驗的胚性愈傷組織，御金球誘導率最高（42.50%），其誘導過程如圖2A-F；妃子笑誘導率最低（僅3.39%）；桂味和糯米糍未能誘導出胚性愈傷組織。可見，基因型對荔枝葉片愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導影響顯著。

表3 不同基因型對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導的影響Table 3 Effects of different genotypes on the induction of embryogenic callus from lichi leaves

圖2 御金球荔枝胚性愈傷組織誘導過程Fig.2 Induction process of embryogenic callus of Yujinqiu

2.3 不同外植體來源、時期和接種方式對荔枝葉片胚性愈傷誘導的影響

從表4 可以看出，不同來源及時期葉片對荔枝胚性愈傷組織誘導影響顯著。成年樹體上葉片無法誘導出胚性愈傷組織（圖2G-I），且外植體褐化率高，其原因可能是接種前的消毒作用使葉片受損嚴重導致外植體活性下降，或是成年樹體葉片中酚類物質代謝旺盛，培養基條件不足以抑制或降低酚類物質濃度而導致外植體大量褐化。而2～4 周的無菌苗葉片均能誘導出胚性愈傷組織（圖2A-F），尤以葉齡2 周的材料誘導率最高（36.44%），這可能與未經消毒和酚類物質代謝程度低有關。后期試驗還發現，隨著苗齡增長，苗齡1 年以上的幼嫩葉片誘導出胚性愈傷組織的能力越來越弱甚至無法誘導，而成年樹體上不同時期的葉片均無法誘導出胚性愈傷組織。

4 種不同接種方式對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導的影響差異顯著。其中，“正面朝上”接種的外植體誘導率最低、僅為3.70%；將外植體“沿主葉脈垂直方向切開兩道傷口后正面朝下”的接種方式，誘導率最高、為43.40%，這可能是因為當葉片“正面朝上”時，葉片僅有葉緣和少量葉面與培養基接觸，而“正面朝下”時有較大葉面積與培養基接觸，即葉片正面與培養基的接觸面積較背面大，將正面朝下貼于培養基表面更利于植物生長調節劑對葉片胚性愈傷組織的誘導。另外，將葉片正面朝下并在葉片上切兩道傷口能顯著提高愈傷的誘導率，說明在不使組織受傷過度死亡的前提下，適當增加外植體傷口有助于愈傷的誘導。因此，本試驗中最適合葉片胚性愈傷組織誘導的外植體接種方式為沿主葉脈垂直方向切開兩道傷口后正面朝下接種。

表4 不同外植體來源及時期對御金球葉片胚性愈傷組織誘導的影響Table 4 Effects of different explant sources and durations on the induction of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

2.4 不同植物生長調節劑對荔枝葉片胚性愈傷組織繼代增殖的影響

以御金球品種誘導出的葉片胚性愈傷組織為實驗材料，利用單因素試驗設計6個處理和2個對照，胚性愈傷組織的生長狀況和增殖率見表5。表5顯示，不同植物生長調節劑組合的增殖率差異顯著，在添加1.5 mg/L 2,4-D的情況下，低濃度6-BA和一定濃度NAA對胚性愈傷增殖有促進作用；在較高濃度6-BA培養基上，繼代培養中愈傷組織容易褐化，影響增殖和后續體細胞胚的誘導。胚性愈傷組織在含有2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L中增殖率最高、為364%；2,4-D 1.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L處理的增殖率最低、近82%。對比對照可知，胚性愈傷在不添加植物生長調節劑的MS培養基上增殖率較低，其胚性愈傷組織生長良好、無褐化現象，但生長緩慢。因此，本試驗中適合葉片胚性愈傷組織繼代增殖的植物生長調節劑組合為2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L，其繼代培養過程見圖3。

表5 不同植物生長調節劑組合對御金球葉片胚性愈傷組織繼代增殖的影響Table 5 Effects of different plant growth regulator combinations on subculture proliferation of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

3 種繼代培養方式的試驗結果見表6，從表6 可以看出，只用J2 培養基進行繼代培養增殖率最高，但其胚性愈傷組織的生長狀態較差，繼代過程中有部分組織褐化且有早期體細胞胚產生，胚性愈傷生長的同步性較 差。J1 和J2 培養基交替繼代、J2 和J3 培養基交替繼代兩種方式下胚性愈傷組織生長狀態無顯著差異，而J2 和J3 培養基交替繼代方式的增殖率相對較高，因此本試驗中適合葉片胚性愈傷組織繼代增殖的方式為MS+2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP 500 mg/L（J2）和MS+2,4-D 0.75mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+PVP 500 mg/L+AgNO32.0 mg/L（J3）培養基交替繼代。

圖3 御金球胚性愈傷組織繼代培養過程Fig.3 Subculture process of embryogenic callus of Yujinqiu

表6 不同繼代方式對御金球葉片胚性愈傷組織增殖的影響Table 6 Effects of different subculture ways on proliferation of embryogenic callus from Yujinqiu leaves

3 討論

3.1 胚性愈傷組織誘導培養的影響因素

胚性愈傷組織培養是體細胞胚發生間接途徑所必須經歷的中間階段，也是成功獲得體細胞胚并進一步培養成再生植株的重要階段［22］。胚性愈傷組織的誘導受多種因素的影響，包括植物生長調節劑、基因型、外植體類型、外加添加劑和培養條件等［23］。基因型作為一種主要的內在影響因素，對愈傷組織的誘導、繼代能力和增殖能力影響很大。荔枝胚性愈傷組織的誘導頻率受基因型影響［24］。本試驗以早、中、晚熟5 個代表性荔枝品種為研究對象，其中御金球和三月紅成功誘導出黃色、組織疏松、生長狀態較好的胚性愈傷組織。

外添不同種類及不同濃度的植物生長調節劑對胚性愈傷組織的誘導影響顯著。2,4-D 的添加與否直接影響荔枝胚性愈傷組織能否被誘導［2］。在本研究中，以2,4-D 的常用濃度2～4 mg/L［25］為參考進行預實驗發現1.5 mg/L 2,4-D 對愈傷組織的誘導效果較好。另外，添加2.0 mg/L KT 或0.5 mg/L NAA 有較高的胚性愈傷誘導率；剛誘導的愈傷組織呈淺綠色、半透明水潤狀，此時的愈傷是沒有胚性的愈傷組織。在培養基中約繼代3 代后，顏色為淺黃/黃色疏松顆粒狀胚性愈傷組織從原組織上長出，說明荔枝葉片愈傷組織需進行繼代培養后才能誘導出胚性愈傷組織。

荔枝的組織或器官在離體情況下會產生大量酚類物質，使組織褐化壞死。克服荔枝外植體褐化是誘導胚性愈傷組織成功的關鍵之一［26］。中國李愈傷組織培養中，PVP 的抗氧化能力最強、AC 次之、CA 最差，且同一防褐化劑的不同濃度對褐化影響較大［27］。本研究中，低濃度PVP 和Vc 對荔枝葉片胚性愈傷組織的誘導和外植體的防褐效果都較小，高濃度AC 雖然防褐化效果最好，但其誘導率也最低，這可能是因為AC 在吸附外植體產生的毒害和酚類物質時也吸附2,4-D，從而降低了誘導率。因此，本試驗中最適合葉片胚性愈傷組織誘導的防褐化劑為PVP，最適濃度為500mg/L。

3.2 胚性愈傷組織繼代培養的影響因素

植物再生體系的關鍵步驟之一在于體細胞胚的發生，而胚性愈傷組織的生長同步性是否一致、在培養過程中是否保持較高的胚性和增值率是其能否脫分化成為體細胞胚的關鍵因素。有研究報道，在胚性愈傷組織繼代培養過程中，植物生長調節劑和添加劑起到至關重要的作用。將番茄胚性愈傷組織誘導培養基中6-BA 和2,4-D 的濃度降低到50%以下，其胚性愈傷組織胚性化保持效果最好、生長速度最快［28］。2,4-D 濃度減半并添加有10 mg/L AgNO3的培養基可誘導和保持松散型胚性愈傷組織［29］。在樟樹胚性愈傷組織誘導培養基中添加200 mg/L 水解絡蛋白和200 mg/L環糊精可保持胚性愈傷組織增殖和體細胞胚誘導［30］。本研究中，適合荔枝葉片胚性愈傷組織繼代培養的植物生長調節劑組合為2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L，并在與該組合減半、添加2.0 mg/L AgNO3的培養基上交替繼代培養保存6 個月，仍具有良好的生長狀態。這為荔枝再生體系技術的建立打下了良好基礎，也為后續試驗提供了優質的原始材料；本試驗結果也進一步說明植物生長調節劑和添加劑的重要性，并且胚性愈傷組織的繼代培養不是簡單的新舊培養基之間的轉移，保持好生長同步性和胚性是繼代培養過程應當重視的問題。

4 結論

對荔枝葉片胚性愈傷組織誘導及其繼代培養條件優化研究結果表明，抽芽后20 d 左右的無菌幼葉在2,4-D 1.5 mg/L+KT 2.0 mg/L 組合下，經2～3 次繼代后三月紅和御金球品種能誘導出胚性組織；添加500 mg/L PVP 能獲得更多胚性愈傷組織。胚性愈傷組織在含有2,4-D 1.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L 中繼代增殖率最高、達364%；并在上述組合濃度減半、添加2.0 mg/L AgNO3的培養基上交替繼代培養保存時間最長、生長狀態最好。