高粱組Ⅲ WRKY 轉錄因子對干旱脅迫的表達分析

（中國熱帶農業科學院湛江實驗站/廣東省旱作節水農業工程技術研究中心，廣東 湛江 524013）

【研究意義】高粱（Sorghum bicolor）是禾本科高粱屬1 年生草本植物，不僅是世界上重要的糧食和能源作物，也是優質的飼料作物。高粱具有耐旱、耐澇、耐鹽堿等多種特性［1］，其基因組較小（約750 Mb），具有豐富的遺傳多樣性，其優良的基因資源在作物改良中具有廣闊的應用前景［2］。轉錄因子又稱反式作用因子，對轉錄過程起誘導或抑制作用［3］。WRKY 轉錄因子作為植物中一類重要轉錄因子，廣泛參與植物生長發育、響應激素誘導和生物及非生物脅迫等生物學進程［4］，開展高粱WRKY基因耐旱性表達特征分析具有重要意義，可為高粱WRKY基因的功能研究奠定基礎。【前人研究進展】WRKY基因家族作為高等植物中備受關注的基因家族之一，自第一個WRKY 轉錄因子基因從甘薯中克隆以來［5］，隨著許多物種基因組測序工作完成，越來越多的WRKY基因從基因組水平上鑒定出來，已在青稞［6］、中粒咖啡［7］、大麥［8］和楊樹［9］基因組分別鑒定了41、49、98、122 個WRKY基因。WRKY 轉錄因子包含1～2 個保守WRKY 結構域，結構域由約60 個氨基酸序列組成，其保守的7 個核心氨基酸序列為“WRKYGQK”。根據WRKY保守結構域數目和鋅指結構類型，可將WRKY 轉錄因子分為組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ三大類，其中組Ⅱ又分為5 個亞類（Ⅱa～Ⅱe）。組ⅠWRKY 轉錄因子包含2 個WRKY 結構域，其鋅指結構的氨基酸類型為C2H2，組Ⅱ和組Ⅲ轉錄因子只含有1 個WRKY 結構域，鋅指類型分別為C2H2、C2HC 型［10］。據報道，WRKY 轉錄因子參與了植物生長發育的許多進程，如開花［11］、次級代謝物合成［12］和衰老［13］等。也有較多研究表明，WRKY 轉錄因子響應各種壓力脅迫，如玉米ZmWRKY62-like基因響應鹽和干旱脅迫［14］；小麥TaWRKY33受鹽脅迫誘導表達，TaWRKY33轉基因擬南芥比對照具有更好的耐鹽性［15］；甜高粱SSWRKY28、SSWRKY76基因的表達結果表明，它們可能在應答干旱脅迫時發揮一定作用［16］；高粱SbWRKY30基因通過影響擬南芥和水稻的根系結構來提高對干旱脅迫的耐受性，擬南芥和水稻的轉基因植株在干旱脅迫后脯氨酸含量、SOD、POD 和CAT 酶活性高于野生型植株，而MDA 含量低于野生型植株［17］。【本研究切入點】前人研究結果表明，組ⅢWRKY 成員廣泛參與植物生長發育進程、生物和非生物脅迫應答反應［18］。趙興奎等［19］已從高粱基因組鑒定了16個組ⅢWRKY成員，但沒有研究其響應逆境脅迫的表達譜。【擬解決的關鍵問題】本研究以高粱品種BTx623 為試材，采用PEG6000 溶液模擬干旱脅迫［20-21］，研究高粱組ⅢWRKY成員響應干旱脅迫的表達譜，為挖掘耐旱候選基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試高粱品種為BTx623，由廣東省旱作節水農業工程技術研究中心保存，該材料有參考基因組序列，為中等耐旱性材料［22］。高粱組ⅢWRKY基因信息來自參考文獻［19］，基因序列下載 自Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

主要試劑：TransZol Plant 植物總RNA 純化試劑盒、Trans2K? Plus DNA Marker、TransStart?Top Green qPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司；ThermoScientific 反轉錄試劑盒K1622，購自Thermo Fermentas 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 干旱脅迫處理 供試高粱種子用1%（W/W）NaClO 溶液浸泡10 min，然后用滅菌的蒸餾水沖洗干凈，采用 0.5×Hoagland 營養液水培，植株在植物光照培養箱中培養，生長條件為28 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗，光照強度為9600 lx。營養液每2 d 更換1 次，待植株生長至3 葉期，用含20%（W/W）PEG6000 的營養液水培，模擬干旱脅迫處理，于處理后0、1、3、6、12 h 收集整株植物，每個樣本混合6 株植物，每個時間點取3個生物學重復樣本。

1.2.2SbWRKY基因的表達譜分析 從NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載有關干旱脅迫的高粱28K 芯片表達數據（GSE48205），利用GeneSpring GX 11.5軟件（安捷倫科技有限公司）進行分析，獲得探針的相對表達倍數，計算log2（fold change）值，然后根據探針對應的基因編號，整理基因的相對表達值。

1.2.3 總RNA 提取、cDNA 合成及熒光定量表達分析 采用植物總RNA 純化試劑盒提取植株總RNA，對總RNA 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性；以總RNA 為模板，使用反轉錄試劑盒獲得cDNA，所用Marker 為Trans2K? Plus DNA Marker。以cDNA 為模板使用qRT-PCR Mix按照操作說明配制反應體系，在LightCycler480 Ⅱ實時熒光定量PCR 儀上進行反應，內參基因選用高粱GAPDH基因。PCR 反應體系（10 μL）：cDNA 1 μL，2×Mix 5 μL，上游引物、下游引物（表1）各0.25 μL，補ddH2O 至10 μL；PCR擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，35 個循環。

1.2.4 qRT-PCR 結果統計分析 按照2-ΔΔCT法計算基因相對表達值［23］。使用EXCEL 的student’s T檢驗進行差異顯著性分析。

表1 高粱組Ⅲ WRKY 基因的qRT-PCR 擴增所用引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR amplification of Group III WRKY genes of sorghum

2 結果與分析

2.1 總RNA 完整性檢測

為保證反轉錄和qRT-PCR 試驗順利開展，本研究對提取的15 個總RNA 樣本進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其完整性較好（圖1），可用于后續試驗。

2.2 SbWRKY 的基因芯片分析結果

為研究高粱響應干旱脅迫的表達特征，從NCBI 數據庫下載的高粱28K 芯片（GSE48205）包含對照、干旱脅迫、熱脅迫和復合脅迫（干旱脅迫和熱脅迫共同處理）共4 組表達值，將表達值導入GeneSpring GX 11.5 軟件，經數據過濾、標準化處理、重要性分析和差異分析等流程，最后篩選得到4 個組ⅢSbWRKY基因的差異表達倍數值（表2）。由結果可知，SbWRKY14、SbWRKY32下調表達；SbWRKY39在干旱、熱脅迫時下調表達，但在復合脅迫時上調表達；SbWRKY41在3 種脅迫處理時均上調表達。

圖1 15 個RNA 樣本的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Detection of 15 RNA samples by agarose gel electrophoresis

表2 不同非生物脅迫下高粱SbWRKY 基因表達值Table 2 Expression values of SbWRKYs in sorghum under different abiotic stresses

2.3 SbWRKY 基因的qRT-PCR 分析結果

為研究組ⅢSbWRKY基因響應干旱脅迫的表達譜，采用PEG6000模擬干旱脅迫于不同時間點取樣，通過qRT-PCR分析基因處理與對照之間的相對表達值，在16個組Ⅲ成員中成功獲得了12個基因的表達譜（圖2）；各基因在干旱脅迫處理后不同時間點與對照（0 h）相比，SbWRKY10在處理后3、6 h下調表達，而在處理后12 h上調表達；SbWRKY14在處理后1、6、12 h下調表達；SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在處理后1、3、6、12 h均下調表達；SbWRKY17在處理后1、6、12 h下調表達；SbWRKY39和SbWRKY89在處理后1、3、12 h下調表達；SbWRKY53在處理后1、12 h下調表達，而在6 h上調表達；SbWRKY75在處理后1 h下調表達，而在3、6、12 h上調表達；SbWRKY93在處理后6 h上調表達。

圖2 干旱脅迫下12 個SbWRKY 基因的表達譜Fig.2 Expression profiles of 12 SbWRKY genes under drought stress

3 討論

WRKY 轉錄因子在響應各種非生物脅迫方面已有相關報道，WRKY 轉錄因子在植物對干旱脅迫的響應中起重要作用［24］。在擬南芥中過表達TaWRKY1和TaWRKY33激活了幾個與逆境相關的下游基因，提高了擬南芥在各種脅迫下的萌發率，促進了根系的生長［25］。在煙草和梨中過表達PbrWRKY53增強了對干旱脅迫的耐受性。與野生型相比，轉基因植株的活性氧生成相對更少、抗氧化酶活性和代謝產物更高。此外，在轉基因煙草中過量表達PbrWRKY53導致PbrNCED1的表達水平提高；敲除PbrWRKY53可下調PbrNCED1的表達豐度，同時降低其耐旱性［26］。水稻組ⅢWRKY 轉錄因子OsWRKY11 在干旱和高溫脅迫時誘導表達，以熱激蛋白HSP101基因作啟動子驅動OsWRKY11表達時，轉基因植株耐熱性和耐旱性增強，葉片萎蔫變慢，離體葉片失水較慢；結果表明OsWRKY11基因在應對高溫和干旱脅迫反應中起重要作用，可能有助于提高植物的抗逆性［27］。

為了解SbWRKY基因在干旱脅迫調控中所起作用，本研究利用公共數據庫基因芯片表達譜數據，分析高粱組ⅢWRKY基因在干旱脅迫、熱脅迫和復合脅迫條件下的表達模式，2 個基因（SbWRKY14和SbWRKY32）在3 種處理條件下均下調表達，1 個基因（SbWRKY41）在3 種處理條件下上調表達。基因的表達趨勢通常反映其相應的功能，在雷蒙德棉中，干旱脅迫處理后，有16 個基因（其中包含3 個組Ⅲ成員）誘導表達，15 個基因表達量減少［28］；本研究通過qRTPCR 技術檢測出12 個基因的表達譜，其中4 個基 因（SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93）在1 個或多個時間點誘導表達，而4個基因（SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42）在所有時間點均抑制表達。這些結果表明，不同的SbWRKY基因在應對干旱脅迫時可能起不同的調控作用。SbWRKY41的qRT-PCR檢測結果與基因芯片檢測的表達譜呈相反表達趨勢，可能是由于兩個研究采用的材料、干旱處理方法不同所致：本研究所用試材為BTx623，以20% PEG6000 模擬干旱脅迫；而芯片試驗所用試材為R16，采用自然干旱脅迫處理［29］。

此外，WRKY 轉錄因子廣泛參與了植物生長發育、各種生物及非生物脅迫進程，如在水稻中已驗證了16 個OsWRKY 轉錄因子的功能，結果表現為Ⅰ類參與抗病進程，Ⅱb 類具有抗病和抗逆功能，Ⅱd 類調控植物的營養生長，而Ⅲ類具有調控營養生長和抗逆等功能［30］。本研究只開展了Ⅲ類基因在干旱脅迫條件下的表達譜分析，這些成員還可能響應低溫、高溫和高鹽等脅迫反應并發揮一定作用。為深入了解這些基因的功能，后續還需克隆這些基因，通過轉基因實驗驗證其生物學功能。

4 結論

高粱WRKY 轉錄因子基因在應對逆境脅迫中起重要調控作用，本研究在前人研究基礎上挑選16 個高粱組ⅢWRKY 轉錄因子基因開展進一步研究。通過基因芯片分析結果表明，SbWRKY14和SbWRKY32在3 種處理條件下全部下調表達，表明這2 個WRKY基因在干旱脅迫、熱脅迫和復合脅迫下具有相似功能；SbWRKY41在3 種脅迫條件下誘導表達。為進一步分析該組成員的表達譜，以20% PEG6000 模擬干旱脅迫，在0、1、3、6、12 h 取樣，采用qRT-PCR 檢測出該組12 個基因的表達譜；SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93在1 個或多個時間點誘導表達，而SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在所有時間點均抑制表達。通過這兩種分析方法，篩選到誘導和抑制表達基因，這為我們今后深入了解SbWRKY基因在干旱脅迫中的調控功能提供參考，也為我們克隆耐旱相關基因提供候選基因。