高效液相色譜串聯質譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤殘留量的不確定度評定

◎ 唐韻熙

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121）

豆芽因其產量高、價格便宜、有利于消化且加工方便，成為人們餐桌上的日常食品，受到普遍歡迎。但在豆芽生產過程中，各地多次出現了黑作坊生產的“毒豆芽”，嚴重危害著廣大消費者的健康。其大多是不法商販為了提高豆芽的產率，縮短豆芽生長周期，在豆芽生產過程中添加4-氯苯氧乙酸（4-CPA）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）等植物生長調節劑以及抗生素類藥物，促進豆芽下胚軸粗大，減少根部萌發，加速細胞分裂，且能起到抗菌、殺菌作用，使豆芽在生長過程中免受微生物的侵蝕。經常食用這些“毒豆芽”，會使人體內殘留高劑量的藥物，可能影響中樞神經[1-9]。《國家食品藥品監督管理總局、農業部、國家衛生和計劃生育委員會關于豆芽生產過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質的公告》（2015年第11號）[10]中明確規定，生產者不得在豆芽生產過程中使用4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤；豆芽經營者不得經營含4-氯苯氧乙酸鈉、6-芐基腺嘌呤的豆芽。

植物生長調節劑的化學性質和生物特性因其種類繁多而各有異同，有較強的基質效應，殘留量低，為提高檢測質量與準確度，需對檢測方法進行不確定度評定。目前，植物生長調節劑僅有6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸和多效唑的非標準方法的不確定度報道[11-12]，因此，本文建立了高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測豆芽中4-CPA、6-BA 含量的測定方法，并且依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[13]、《化學分析中不確定度的評估指南》[14]的相關規定，對該方法的不確定度進行評定，找出影響測定結果的主要因素，并進行不確定度分析計算，進而對檢測結果的準確性進行評判，提高檢測質量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB5500 串聯三重四極桿質譜聯用儀（美國AB SCIEX 公司）、1290 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、3-30KS 型冷凍離心機（德國Sigma 公司）、ML-886 渦旋儀（海門市其林貝爾儀器）、Turbovap LV 全自動濃縮儀（英國Biotage 公司）、Milli-Q reference 型純水機（美國MILLIPORE 超純水系統）、MSA225S-100-DU 電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）、ME203/02 電子分析天平（千分之一，瑞士METTLER TOLEDO 公司）。

4-氯苯氧乙酸（4-CPA）標準品（德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度：98.11%）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）標準品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度：98.51%）、甲醇、乙腈、甲酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、Bondesil-C18。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取10.73 mg 4-CPA、10.24 mg 6-BA 于10 mL 容量瓶中，甲醇溶液定容，配制成濃度分別為1.053 mg·mL-1、1.009 mg·mL-1的標準儲備液。

混合標準溶液1 配制[c（4-CPA）=10.53 μg·mL-1，c（6-BA）=10.09 μg·mL-1]：分別移取100 μL 4-CPA和100 μL 6-BA 標準儲備液至10 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度。

混合標準溶液2 配制[c（4-CPA）=1.053 μg·mL-1，c（6-BA）=1.009 μg·mL-1]：準確移取1 mL 混合標準溶液1 至10 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度。

標準系列工作溶液配制：分別準確移取10 μL、20 μL、40 μL 混合標準 溶 液2，10 μL、15 μL、20 μL 混合標準溶液1 于1 mL 容量瓶中，用陰性基質定容至刻度。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

稱取5 g均質的豆芽樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 的1%甲酸乙腈溶液，振蕩渦旋5 min，加入2 g 無水硫酸鎂、0.5 g 無水乙酸鈉，迅速振搖，于9 000 r·min-1離心10 min，準確移取4 mL 上清液至干凈離心管中，45 ℃氮吹干，加入1 mL 甲醇溶解，超聲5 min，轉移上述溶解液于1.5 mL 凈化小管中（內含75 mg 無水硫酸鎂，25 mg C18），渦旋2 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm 濾膜，待LC/MS/MS 分析。

1.3.2 液相色譜

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動相A：0.1 %甲酸水溶液；流動相B：乙腈。梯度洗脫程序：0 ～0.5 min，10% B，0.5 ～2.5 min，10% B →90% B，2.5 ～4.5 min，90% B，4.5 ～4.6 min，90% B →10% B，4.6 ～6.5 min，90% B，流速為0.3 mL·min-1，進樣量1 μL。

1.3.3 質譜條件

電噴霧（ESI）離子源，負離子模式；掃描模式：多反應監測（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子源電壓：4 500 V；氣簾氣壓力：275.79 kPa；GAS1：379.21 kPa，GAS2：379.21 kPa；目標化合物的監測離子對，去簇電壓（DP）和碰撞能（V）參數見表1。

表1 4-CPA 及6-BA 的母離子、子離子及其他質譜參數表

1.3.4 數學模型

樣品中待測組分的含量的計算公式為：

式中，X-樣品中待測組分的含量，單位為μg·kg-1；C-從標準曲線得出的樣品溶液中待測組分的濃度，單位為ng·mL-1；V-樣品溶液最終定容體積，單位為mL；m-稱樣量；fr-待測組分的回收率（%）；2.5-稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 樣品的不確定度來源

根據試驗測試過程，分析影響豆芽試樣中4-CPA及6-BA 殘留量測定結果的各種不確定的因素，評價不確定度來源主要有：樣品前處理制備、標準溶液的配制（包括儲備液與混合中間溶液的配制過程）、標準工作溶液配制、根據擬合標準曲線求得樣品濃度、回收率以及測試儀器。

2.2 由樣品前處理引入的相對不確定度urel（樣品）

樣品前處理引入的不確定度主要有樣品稱量urel（m樣）、加入提取試劑0.1%甲酸乙腈體積urel（V10mL）、移取4 mL提取試劑urel（V4mL），最終定容體積urel（V1mL），各分量不相關，具體見表2。合成樣品前處理制備的相對不確定度為：

表2 樣品前處理引入的不確定度表

2.3 標準溶液配制引入的相對不確定度urel（s）

標準溶液配制引入的相對不確定度主要來源于標準儲備液配制urel（s1）、標準中間溶液配制urel（s2）和urel（s3）、標準工作溶液配制urel（s4）。

2.3.1 標準儲備液配制引入的相對不確定度urel（s1）

其主要來源有：標準品純度引入的不確定度urel（p）、標準品稱量引入的不確定度urel（ms）、10 mL容量瓶校準和溫度效應引入的不確定度urel（V10mL），具體見表3。

表3 標準儲備液配制引入的相對不確定度表

續表3

2.3.2 混合標準中間溶液配制引入的相對不確定度urel（s2）和urel（s3）

混合標準中間溶液1、2 配制過程中引入的不確定度主要是：200 μL 移液槍、1 mL 移液槍、10 mL容量瓶以及容量瓶溫度效應。根據移液槍校準證書，200 μL 和1 mL 移液槍最大允許誤差分別是±0.3%和±0.4%，按矩形分布，k=，則兩者產生的相對標準不確定度為：

由表3 可知，10 mL 容量瓶引入的相對不確定度urel（V10mL）=0.003 38，將上述分量合成標準不確定度為

2.3.3 標準工作溶液配制引入的相對不確定度urel（s4）

標準工作溶液是由豆芽陰性基質逐級稀釋混合標準中間溶液配制而成的。配制過程中引入的不確定度分量及數值見表4[15]，則合成各個標準溶液濃度點引入的相對不確定度為：

表4 標準工作溶液配制過程中引入的不確定度表

2.4 根據擬合標準曲線求得樣品濃度引入的不確定度u（y）

將標準曲線的6 個濃度點每個進樣3 次，以目標物的質量濃度為橫坐標（C，ng·mL-1），目標物分子離子峰的峰面積為縱坐標（A）進行線性回歸，回歸方程、相關系數r見表5。

標準曲線擬合產生的不確定度按式（3）計算：

其中Sr按公式（4）計算：

式中Sr為標準溶液峰面積殘差的標準差，Sr（4-CPA）=21.414 4；Sr（6-BA）=15.778 1；m為 標準溶液濃度點個數，m=6；n為標準溶液測定次數，n=3；p為待測物質測定次數，p=3，為標準溶液的平均濃度；a為斜率，b為截距。

表5 標準曲線回歸方程及線性表

將被測樣品平行測定3 次，分別從標準曲線算出的4-CPA 和6-BA 化合質量濃度Cx（ng·mL-1）見表6。

表6 被測樣品的測定數據表

被測樣品由標準曲線擬合產生的相對標準不確定度為：urel（y4-CPA）=0.041 56，urel（y6-BA）=0.040 13。

2.5 回收率測試過程引入的不確定度urel（fr）

在6份空白豆芽試樣中分別加入絕對含量為52.65 ng的4-氯苯氧乙酸（4-CPA）和50.45 ng 6-芐基腺嘌呤（6-BA）混合標準溶液，按照1.3.1、1.3.2 和1.3.2 試樣制備和儀器條件進行操作，結果見表7。按照式以下公式計算標準偏差、回收率不確定度和回收率相對不確定度。

計算標準偏差：

回收率不確定度：

回收率相對不確定度：

表7 回收率引入的不確定度表

用t檢驗法，，來檢驗回收率是否與100%存在顯著差異性，結果見表7。由于t值>臨界值（2.57），說明平均回收率與100%回收率之間有顯著性差異，回收率矯正因子必須在計算公式中采用，以修正結果。

2.6 檢測儀器引入的相對不確定度urel(fm)

根據《液相色譜-串聯質譜 儀器校準證書》知，urel(fm)=4.0%。

3 標準不確定度的合成與擴展

3.1 各分量不確定度匯總

對于豆芽中4-CPA 和6-BA 測定結果有影響的各種不確定分量來源匯總見表8。

表8 各分量不確定度匯總表

3.2 合成標準不確定度

由于上述各因素的不確定度互不相關，合成豆芽中4-CPA 和6-BA 含量的相對不確定度為：

3.3 相對擴展不確定度

在95%置信水平下，k=2，4-CPA 的相對擴展不確定度為u（4-CPA）=9.06×0.095 14=0.86 μg·kg-1；6-BA的相對擴展不確定度為u（6-BA）=9.41×0.093 98=0.88 μg·kg-1。

3.4 測定結果

按照該方法測定豆芽中4-CPA 含量的結果為：X（4-CPA）=（9.06±0.86）μg·kg-1，k=2；X（6-BA）=（9.41±0.88）μg·kg-1，k=2。

4 結論

通過不確定度評定分析，采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測中豆芽中4-CPA 和6-BA 含量的過程中，樣品前處理制備引起的不確定度最大，其次是由儀器以及標準溶液配制和通過標準曲線擬合求得樣品濃度值過程帶入。因此，在實際工作中應對樣品前處理進行規范操作，同時選取精密性高的儀器進行檢測，高精密度天平精密稱量，高精密度的移液槍和容量瓶進行溶液配制，從而提高檢測結果的準確度和可靠性。