基于網絡藥理學和分子對接探討威麥寧治療肺腺癌的機制研究

胡 偉，陶姣陽，莫澤君，林耀煌，梁 嬌，李嘉凱

(浙江大學醫學院附屬第二醫院藥學部，浙江 杭州 310009)

無論是在全球或者是在我國，肺癌都已成為癌癥發病率和死亡率首位，據19年國家癌癥中心發布的數據，15年我國新發肺癌病例約78.7萬例，死亡病例約63.1萬例[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總病例數的80%～85%，而肺腺癌(LUAD)為其主要病理類型，約占NSCLC的60%。LUAD發病隱匿不易察覺，早期就診患者較少，對于晚期或轉移患者主要治療手段為化療和放療，而放化療具有嚴重毒副作用，并會大大降低患者的生活質量。因此，LUAD患者迫切需要臨床療效穩定和毒副作用小的治療方案。

威麥寧膠囊是從金蕎麥的干燥根莖中，使用現代技術提取的活性成分，作為我國首個治療肺癌單方中成藥[2]，具有清熱解毒、活血化瘀、驅邪扶正等作用，臨床主要配合放、化療治療腫瘤有增效減毒作用，也用于不適宜放、化療肺癌患者的治療。雖然，相關的臨床觀察研究發現[3-4]，威麥寧膠囊配合放化療治療NSCLC患者能帶來明顯的臨床獲益，但是關于其發揮抗腫瘤作用的內在藥理學機制卻鮮有報道。

網絡藥理學是一種集合系統生物學、組學和計算生物學，并基于成分、疾病、靶點之間相互作用網絡的系統研究方法，可以系統的揭示藥物治療疾病的作用機制[5]。中藥具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點，而網絡藥理學相較于傳統的試驗方法，能夠以科學的分析方法全面的闡述中藥潛在的作用機制[6]。分子對接技術是根據結構生物學的原理，利用計算機高精度對接模擬，并將蛋白和配體的結合位點和潛力進行評估，是發現和確認藥物靶點快捷有效的新途徑[7]。本文基于網絡藥理學的方法，分析研究威麥寧膠囊有效成分治療LUAD的可能的作用靶點，并通過分子對接技術進行評估確認，提高結果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 威麥寧膠囊的有效成分及相關靶點的篩選威麥寧膠囊為金蕎麥干燥根莖的提取物，通過檢索TCMSP(https:// tcmspw.com/ tcmsp.php)、TCMID(http://119.3.41.228:8000/ tcmid/)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php)和ETCM(http://www.tcmip.cn/ ETCM /index.php)數據平臺收集金蕎麥根莖(Rhizoma Fagopyri Cymosi)的化學成分，根據ADME參數篩選活性成分，設定同時滿足口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18的成分作為活性成分[7]，同時利用TCMSP和DrugBank(https://www.drugbank.ca/)預測活性成分靶點。并且根據已發表的文獻，補充其活性化合物及其靶點。篩選所得靶點，需在Uniprot數據庫(https://www. uniprot.org)將活性成分作用的蛋白質靶點進行統一規范。

1.2 肺腺癌的差異表達基因的獲取從GEO數據庫搜索組織來源為人，同時含有肺腺癌和正常肺組織樣本的基因表達數據集，篩選出GSE116959和GSE43458兩個探針芯片數據集。GSE 116959芯片包含57個肺腺癌組織和11個正常肺組織樣本基因表達譜，GSE43458芯片包含80個肺腺癌組織和30個正常肺組織樣本的基因表達譜。本研究利用R語言的limma軟件包對芯片進行基因差異分析，ggplot2軟件包繪制火山圖，根據相關參數adj.P<0.05和差異倍數∣logFC∣>1作為篩選條件。

1.3 交集靶點及其相互作用網絡構建為明晰藥物作用靶點與肺腺癌差異表達靶點之間的關系，本研究將所得靶點信息輸入在線Venn分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，并繪制Venn圖，獲得藥物與疾病的交集靶點。然后，將交集靶點輸入蛋白交互作用網站String(https://string-db.org)，生物種類選擇“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設置“medium confidence”(>0.4)，其他參數選擇默認值，即可得到PPI網絡。使用CytoScape 3.7.2將所得PPI結果進一步美化，得到交集蛋白PPI網絡圖。

1.4 GO和KEGG通路富集分析Metascape平臺(http://metascape.org/gp/index.html)擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數據資料。將威麥寧治療肺腺癌的作用靶點輸入Metascape平臺，設置P<0.01，最小基因數=3，富集因子>1.5。將其主要的GO與KEGG通路進行富集分析，然后利用R語言ggplot2軟件包將結果繪制氣泡圖。

1.5 核心靶點的提取和分析使用CytoScape 3.7.2中的CytoHubb插件，利用MCC算法，提取得到排名前10個蛋白的相互作用網絡圖，將其作為核心基因并進行KEGG通路富集分析。

1.6 分子對接將威麥寧的主要有效成分和10個核心靶點，用Autodock軟件進行分子對接。使用TCMSP數據庫，下載藥物小分子化合物的MOL2格式文件，并通過pymol轉換為PDB格式；然后通過PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)下載靶蛋白與其他配體結合的復合物的PDB格式文件，對接區域即原始配體所在位置。使用Autodock軟件在對接時，選擇Genetic Algorithm作為對接算法，并設置輸出樣品數為100，計算次數為27 000，其他參數使用默認值。

2 結果

2.1 威麥寧膠囊的有效成分及相關靶點通過檢索幾個數據庫，根據篩選條件OB≥30%和DL≥0.18，共獲得15個有效成分；然后通過檢索相關文獻[2]，發現原花青素b2(Procyanidin b2)為威麥寧膠囊的重要活性成分，于是將其歸入有效活性成分見Tab 1所示。通過TCMSP和DrugBank對獲得的16個活性成分進行相關靶點的預測，然后使用Uniprot(https://www. uniprot. org/)數據庫將所得靶點蛋白進行規范化處理，結果總共獲得353個有效靶點；使用Cytoscape 3.7.2軟件對所得的活性成分和靶點進行可視化網絡展示，如Fig 1所示。網絡圖中紅色六邊形代表有效成分，紫色圓形代表degree>3的靶點，淡藍色菱形代表degree≤3的靶點，節點越大代表degree值越大。結果顯示木犀草素(luteolin)和槲皮素(quercetin)的degree值分別為154和57，很可能是威麥寧膠囊發揮藥理作用的主要活性成分。

Tab 1 Main active ingredients of Weimaining

2.2 肺腺癌的差異表達基因使用R語言limma軟件包對GSE116159和GSE43458數據集進行基因差異分析，分別獲得肺腺癌(LUAD)相對正常肺組織存在1 862和746個差異基因，GSE116159中表達上調的有674個，下調的1 188個，GSE43458中表達上調291個，下調455個。將兩個數據集獲得的差異基因取并集，總共得到2 217個可能與LUAD有關的差異基因。將結果用R語言繪制火山圖展示，見Fig 2、3。

Fig 1 Component-target network of Weimaining

Fig 2 Volcano map of GSE116159 differential genes

Fig 3 Volcano map of GSE116159 differential genes

Fig 4 Venn diagram of targets of Weimaining and LUAD

2.3 交集靶點及其相互作用網絡將威麥寧膠囊主要有效成分所對應的靶點進行去重后，共獲得204個潛在作用靶點，同時通過對兩個LUAD數據集數據挖掘，共獲得2 217個和LUAD相關的差異表達基因。然后將藥物和疾病所對應的靶點分別導入在線Venn分析工具，獲得41個交集靶點，并繪制Venn圖，見Fig 4。最后將獲得的41個共同作用靶點，利用蛋白交互網站String進行蛋白相互作用分析，并將其結果導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化，結果見Fig 5。PPI網絡中共有39個節點(去除2個獨立節點)，162條邊，節點大小和節點顏色根據degree值排序，degree值越大節點越大顏色越亮；邊的粗細和顏色根據combined score排序，combined score值越大邊越粗顏色越亮。

Tab 2 MCC Score values of core targets

Fig 5 PPI network at intersectiontargets of Weimaining and LUAD

Fig 6 GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of intersection targets

Tab 3 KEGG pathway enrichment analysis of core targets

Tab 4 Docking results of main active componentsof Weimaining with core targets

2.4 GO和KEGG通路富集分析將之前獲得威麥寧膠囊治療LUAD的41個靶點基因放入Metas-cape平臺，分別進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO 富集分析主要包括BP(Biological Processes)、CC(Cellular Components)、MF(Molecular Function)，利用R語言將結果繪制成氣泡圖，橫坐標為Gene ratio，縱坐標為富集結果，富集結果的-log10(Qvalue)值以顏色表示，氣泡大小表示基因Count值，見Fig 6。

細胞組分(CC)的富集結果，顯示威麥寧膠囊和LUAD的交集基因主要分布在RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、細胞膜筏、濃縮的染色體、ficolin-1-rich顆粒內腔和內質網腔等細胞部位。

分子功能(MF)富集的結果，顯示交集基因主要是對G蛋白偶聯胺受體、功能類固醇激素受體、氧化還原酶和絲氨酸肽鏈內切酶的活性影響，以及通過與蛋白激酶、整合素、轉錄因子和生長因子的結合，從而發揮作用。

生物過程(BP)的富集結果，顯示交集基因主要富集在對細胞死亡的正向調節、細胞增殖的負調控、DNA結合轉錄因子活性的調控、多細胞生物過程、對金屬離子反應、對細胞外刺激的反應、細胞對激素刺激的反應和對含嘌呤化合物的反應等生物過程。

KEGG通路富集分析結果顯示，41個交集基因顯著富集在12條通路上(Qvalue<0.01)。包括液體剪切應力和動脈粥樣硬化、癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、p53信號通路、癌癥中的轉錄失調、cAMP信號通路、金屬鉑耐藥等通路，也說明威麥寧膠囊可以通過多靶點多通路協調作用，從而發揮治療LUAD的功效。

2.5 核心靶點的提取和分析使用CytoHubba插件，選擇MCC方式進行核心靶點的提取，根據MCC score提取前10的靶點，如Tab 2所示。將Top10的靶點利用Metascape分析平臺進行KEGG通路富集分析，所得結果與交集靶點結果基本一致，主要富集在IL-17信號通路，癌癥通路和癌癥中的轉錄失調這3條通路，見Tab 3。

2.6 主要活性成分和核心靶點的分子對接威麥寧膠囊中活性成分對應靶點的網絡圖中，顯示木犀草素(luteolin)和槲皮素(quercetin)很可能是其發揮藥理作用的主要活性成分。通過威麥寧膠囊和LUAD所獲得的交集靶點的PPI網絡圖，然后使用CytoHubba獲得10個核心靶點。從TCMSP數據庫獲取木犀草素和槲皮素的mol2結構式，PDB數據庫下載核心蛋白的pdb結構式，使用Autodock軟件進行分子對接，結合能(Binding energy)越小說明配體和受體結合越穩定，越可能發生相互作用。然后使用Pymol軟件對所得對接結果進行可視化展示。結果顯示木犀草素和槲皮素與核心靶點結合性較好，結合能均小于0 KJ·mol-1并顯示著相同的趨勢，如Tab 4所示，排在前五位的靶點蛋白為MMP-9、MMP-1、CAT、PLAU和PPARG。

3 討論

本研究利用網絡藥理學和分子對接的方法，探討了威麥寧膠囊治療LUAD的潛在作用機制。通過數據庫、基因芯片數據挖掘以及分子對接的結果找出了威麥寧的主要活性成分木犀草素和槲皮素，以及可能通過與MMP-9、MMP-1、CAT、PLAU和PPARG發生相互作用，作為威麥寧膠囊治療LUAD的主要靶點。

MMP-9和MMP-1都屬于基質金屬蛋白酶(MMPs)，一種鋅依賴性內肽酶，MMPs的基因多態性與肺癌的易感性存在相關性，比如MMP-1-16071G/2G基因型在亞洲人中發現肺癌風險增加，而MMP-9-1562C/T基因型很可能是肺癌的保護因素[8]；并且已發現在MMP-9和MMP-1多種腫瘤組織中均為高表達，而降低MMP-9和MMP-1的表達不僅可以抑制NSCLC細胞的活力和遷移能力，還能提高耐藥細胞對EGFR抑制劑的敏感性[9]。CAT為過氧化氫酶，可以保護細胞免受過氧化氫的毒性作用，促進T細胞、B細胞、肥大細胞和成纖維細胞的生長，CAT可以降低組織中過多ROS引起的損傷，與癌旁組織相比，在NSCLC細胞中，CAT的表達量和活性都會降，同時CAT可以產生氧來克服腫瘤細胞的缺氧，進而增加效應T細胞的浸潤，同時耗盡腫瘤中的免疫抑制細胞，增強PD1單抗的療效[10]。PLAU尿激酶型纖溶酶原激活劑，除了可以激活纖溶酶原，還與肺癌細胞的增殖，侵襲和轉移有關，如KLF17通過Src/p38/MAPK信號通路抑制PLAU可以抑制LUAD的侵襲[11]。PPARG是一種配體激活的轉錄因子，屬于過氧化物酶體增殖活化受體(PPARs)家族，PPARs受體的激動劑能有效的抑制LUAD細胞的增殖，發現PPARG蛋白過表達或者激動劑羅格列酮的誘導，可以增強輻射誘導的NSCLC細胞的凋亡，并且這種放射增敏效應是由Bax介導[12]。

KEGG通路富集分析結果顯示，威麥寧膠囊治療LUAD的潛在作用機制除了直接作用于癌癥通路，癌癥中的轉錄失調以及金屬鉑耐藥，還包括流體剪切應力和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、p53信號通路、cAMP信號通路等通路。流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路對血管的再生有著重要的調節作用，流體剪切應力可以調節血管內皮細胞中相關基因的表達，影響著內皮細胞的形態、分化、遷移和增殖[13]。AGE-RAGE信號通路主要是指晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)與其受體RAGE結合后可啟動一系列信號轉導反應，合成和釋放多種細胞因子和生長因子，誘導ROS生成增多，誘發氧化應激和炎癥反應。目前，在人類肺癌組織中均發現RAGE 蛋白表達，并參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、自噬、侵襲、遠處轉移及耐藥[14]。p53信號通路廣泛作用于多種腫瘤組織，可以調節多種基因表達，加速DNA的損傷修復，調節細胞周期，誘導細胞凋亡等作用。研究表明，促進p53蛋白的合成，抑制p53的泛素化和降解，可以促進LUAD細胞凋亡，抑制LUAD的進展[15]。cAMP信號通路，通過調節細胞內第二信使cAMP的水平而引起反應的信號通路，在基因調控，以及細胞遷移、增殖、凋亡等過程中發揮著重要作用[16]。

目前已有相關的臨床研究證明，威麥寧膠囊聯合放療或化療在治療LUAD患者臨床觀察研究中，改善患者免疫狀態，提高療效，減輕放化療毒性，延長患者生存期[3-4]。 但是關于其作用的藥理學機制，影響的通路及具體蛋白卻很少有人研究，本文研究的重要性就得到很好的體現。

綜上所述，本文通過網絡藥理學和分子對接的方法，闡明了威麥寧膠囊治療LUAD主要有效成分、作用靶點，以及相關的通路，發現其可以通過直接細胞抑制作用和增加放化療的敏感性發揮療效。但是想要揭示其分子學機制，仍需要通過進一步的體內外研究對本文的研究結果進行驗證，這也將是作者接下來要進行的工作。