Nrf2/HO-1/GPX4對高糖誘導足細胞鐵死亡的影響及小檗堿的干預機制研究

關錫梅，解勇圣，倪偉建，唐麗琴

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.中國科學技術大學生命科學與醫學部，安徽 合肥 230001；3.安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032；4.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)藥劑科，安徽 合肥 230001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是II型糖尿病中最嚴重的微血管并發癥之一，其發病機制復雜，已成為世界范圍內終末期腎臟病的首要原因[1]。足細胞作為腎臟組織中重要的固有細胞，位于腎小球基底膜的最外層，與內皮細胞層、腎小球基底膜共同構成了腎小球的3層濾過屏障，以保證腎小球毛細血管壁的選擇通透性。研究發現，足細胞特殊的形態和結構對腎小球的完整性起到關鍵作用，其結構完整以及數量的恒定可以維持腎臟的正常濾過能力[2]。研究足細胞的死亡方式，為其治療提供新的方向和靶點已經成為該領域的研究熱點。

細胞的死亡方式包括凋亡、自噬、鐵死亡、壞死及焦亡等。鐵死亡是新定義的一種區別于凋亡、自噬的細胞程序性死亡過程，特征在于細胞內脂質氧自由基的異常增高[3]。文獻報道前列腺素內過氧化物合酶(prostaglandin endoperoxide synthase 2, PTGS2)在鐵死亡發生時被顯著上調；ACSL4作為脂肪酸代謝的第一步，在體內催化合成脂酰CoA，將長鏈多不飽和脂肪酸活化[4]，以參加膜磷脂的合成，但是這些膜上的長鏈不飽和脂肪酸常被氧化，從而誘發鐵死亡。GPX4作為氧化應激和細胞死亡信號的傳感器，其表達量的降低會導致體內活性氧的明顯升高，被認為是觸發鐵死亡程序的重要靶點。

小檗堿(berberine，BBR)是天然植物黃連根莖中提取的生物堿，具有抗氧化應激[5]、抗炎、降低血糖的作用。課題組前期已經深入研究了高糖刺激下足細胞自噬與凋亡的關系，但是對于足細胞中鐵死亡的現象還有待進一步的探討。小檗堿可以通過調節凋亡自噬相關信號通路，明顯改善高糖刺激下足細胞的凋亡[2, 6]以及系膜細胞增殖[7]的情況，但對于足細胞內鐵死亡現象的調控作用尚未研究。此次實驗采用體外持續性高糖刺激足細胞模擬糖尿病腎病的體內環境，探究凋亡發生之前足細胞是否存在鐵死亡現象，進一步探討小檗堿緩解高糖誘導足細胞損傷的作用機制，在臨床上為疾病發生的更早階段提供新思路和實驗依據，進而尋找到新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞培養 腎小球足細胞MPC5，購于北京北納創聯生物技術研究院，貨號: 337685; 在33 ℃，10%血清，1%雙抗，1×104U·L-1γ-干擾素條件下增殖，經37 ℃無γ-干擾素誘導10-14 d后分化成熟。

1.1.2藥物 鹽酸小檗堿, 購于北京北納創聯生物技術研究院，貨號為: BWB50137，純度≥98%。

1.1.3試劑 CCK-8細胞活力試劑盒，貝博生物(貨號：BB4202)；小鼠重組γ干擾素，MCE公司(批號：33158)；BeyoClickTMEdU-488細胞增殖試劑盒，碧云天(貨號：C0071S)；GSH和GSSG檢測試劑盒，碧云天(貨號：S0053)；RPMI 1640培養基，Hyclone公司(貨號：SH30809.01)；GAPDH，HO-1，均購自Cell Signaling Technology(貨號：5174，#82206);Nrf2，GPX4購自美國abcam公司(貨號：ab137550，ab125006)，desmin購自Proteintech公司(貨號：60226-1-lg)；podocin，購自Santa cruz(貨號：sc-518088)；BCA 試劑盒，碧云天(貨號: P0010S)；胎牛血清，Biological Industries(貨號：2022057); 辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠lgG，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔lgG，Proteintech 公司；兩步法逆轉錄試劑盒，Vazyme(貨號：R323-01)；SYBR qPCR試劑盒，Vazyme(貨號：Q711-02)；TRIzol試劑盒，Invitrogen。

1.1.4儀器 CO2培養箱(Heal Force公司) ; 流式細胞儀(Beckman Coulter 公司) ; 酶標儀(Molecular Devices公司) ; 凝膠成像系統(Peiqing公司) ; 熒光倒置顯微鏡(Leica公司)；激光共聚焦顯微鏡(Leica 公司)；熒光定量ABI7500(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1足細胞活力檢測 96孔板中接種合適細胞密度分化成熟的足細胞，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h后進行不同處理。設置空白對照組(blank)，正常對照組，高糖模型組(33.3 mmol·L-1)以及不同濃度小檗堿(終濃度為7.5、15、30、60、90、120、150 μmol·L-1)組，37 ℃繼續培養24 h。按照CCK-8試劑盒說明進行后續操作，用酶標儀測定每孔450 nm處的吸光度，并計算細胞的活力值。

1.2.2EdU檢測足細胞增殖 將合適密度(1×105個)足細胞接種于24孔板中，培養 24 h 后，不同組經高糖刺激不同時間(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h)后，按照試劑盒操作固定細胞并染色，將24孔板置于熒光倒置顯微鏡下，以495 nm激發波長，519 nm 發射波長拍照，EdU綠色熒光代表正處于DNA復制期的細胞，Hoechst熒光代表所有的活細胞。

1.2.3活性氧水平的測定 將合適密度足細胞接種于6孔板，置于37 ℃，5% CO2下培養24 h后，依次加入正常培養基，高糖培養基(33.3 mmol·L-1)以及小檗堿 (60 μmol·L-1)溶液，37 ℃繼續孵育24 h后，棄去上清液，每孔加入2 μL DCFH-DA(非標記性的氧化敏感的熒光探針，終濃度為10 μmol·L-1)，置于37 ℃繼續孵育20 min。最后，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次后，熒光顯微鏡下調整參數至激發波長為488 nm，發射波長為525 nm后進行拍照。

1.2.4谷胱甘肽水平的測定 收集各組細胞，吸棄上清，按照試劑盒說明對細胞樣本進行處理：加入3倍細胞沉淀體積的蛋白去除試劑M溶液，充分Vortex后，對樣品進行兩次液氮和37 ℃的快速凍融后4 ℃放置5 min，4 ℃高速冷凍離心機，10 000g離心10 min。取上清立即用酶標儀測定A412，并對比各組的含量變化情況。

1.2.5激光共聚焦顯微鏡檢測 將分化成熟的足細胞在激光共聚焦小皿中培養，室溫4%多聚甲醛對細胞進行固定，經PBS 洗滌3次后，3%的BSA 封閉30 min，并與 desmin一抗(1 ∶500) 4 ℃孵育過夜。次日，室溫下與二抗(1 ∶200)孵育2 h，隨后進行 DAPI 染色10 min，PBS洗滌后即可在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6透射電子顯微鏡 收集不同處理組細胞，使用戊二醛 在4 ℃固定12 h，1%OsO4固定2 h后，梯度乙醇脫水，70%醋酸鈾染色6 h，乙醇脫水后環氧樹脂包埋3 h，并在60 ℃烘箱中放置48 h，使用超微切片機切片(NOVA, LKB, Sweden)。最后用鉛和鈾對樣品進行染色，并用透射電子顯微鏡(HT7700)進行觀察。

1.2.7Western blot 收集不同處理組的細胞，使用RIAP裂解液提取細胞總蛋白和細胞核蛋白提取試劑盒提取胞核蛋白，經BCA試劑盒蛋白定量后，通過SDS-PAGE凝膠電泳對蛋白樣品進行分離后即轉移至乙醇活化后的PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST漂洗3次，每次10 min；辣根過氧化酶標記的二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，1×TBST漂洗3次后，ECL顯影。蛋白條帶使用ImageJ進行灰度分析, 以GAPDH為內參基因計算各組蛋白的相對表達水平。

1.2.8RNA提取及RT-qPCR 取處理好的細胞，按照TRIzol提取說明書收集細胞總RNA，測定其濃度和純度后保存于-80 ℃。按Vazyme試劑盒R323-01反應程序：42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 合成cDNA；產物立即用于實驗或-20 ℃保存。取稀釋后cDNA按照real-time PCR說明書進行反應，反應程序為：預變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；溶解曲線為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s。GAPDH 上游引物為：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物為:5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′；Nrf2 上游引物為:5′-CTCCTGGACGGGACTATTGA-3′，下游引物為:5′-TGGGTCTCCGTAAATGGAAG-3′；HO-1 上游引物為:5′-CACGCATATACCCGCTACCT-3′，下游引物為:5′-CCAGAGTGTTCATTCGAGCA-3′；GPX4上游引物為:5′-TGTGCATCCCGCGATGATT-3′，下游引物為:5′-CCCTGTACTTATCCAGGCAGA-3′。每組設置 3 個復孔，運用2-ΔΔCT的方法進行數據統計。

2 結果

2.1 不同高糖刺激時間對足細胞標志蛋白desmin、podocin及鐵死亡標志物GPX4、PTGS2、ACSL4的影響Western blot 結果顯示，隨著高糖刺激時間的增加，在12 h時，desmin發生明顯上調(P<0.01)；足細胞特異性蛋白podocin與鐵死亡標志物GPX4在24 h蛋白表達水平達到最低(P<0.01)；見Fig 1A, B。RT-qPCR結果顯示隨著高糖時間的增加，GPX4的mRNA水平在24 h顯著性下調(P<0.05)；ACSL4的mRNA水平在24 h發生明顯變化(P<0.01)，并在36 h有降低的趨勢；PTGS2的mRNA水平在12 h發生明顯上調且一直升高(P<0.01)；見Fig 1C。

2.2 EdU檢測高糖刺激不同時間足細胞的增殖情況結果如Fig 2所示，圖中綠色細胞為處于增殖狀態的細胞，藍色細胞表示總的細胞。染色結果顯示隨著高糖刺激時間的增加，足細胞的增殖速率在24 h明顯降低。

2.3 BBR對高糖損傷足細胞活性的影響Fig 3的CCK-8結果顯示，高糖刺激24 h后，足細胞活力明顯下降；與高糖模型組比較，小檗堿(30、60、90 μmol·L-1)差異均有顯著性，可以不同程度地增強足細胞的活力。

Fig 1 Relative expression of desmin, podocin, GPX4, ACSL4 and PTGS2 in HG-induced podocytes at different time points n=3)

2.4 BBR對高糖誘導足細胞標志及鐵死亡相關信號通路蛋白的影響Podocin是維持足細胞功能完整性的重要蛋白。Nrf2/HO-1/GPX4信號通路與鐵死亡密切相關。Western blot結果表明，與正常對照組相比較，高糖組足細胞的podocin、GPX4的蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與高糖模型組比較，BBR(60 μmol·L-1)能明顯增加podocin、Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的表達(P<0.01)(Fig 4)。RT-qPCR結果顯示，高糖組的PTGS2、ACSL4比正常對照組明顯升高(P<0.01)，GPX4明顯下調(P<0.01)，Nrf2、HO-1基本不變；與高糖組相比，小檗堿(60 μmol·L-1)可以明顯降低PTGS2和ACSL4的mRNA表達(P<0.01)，并且升高Nrf2、HO-1、GPX4的mRNA水平(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 2 Effect of podocyte proliferation by high glucose at different time points (×200, n=3)

Fig 3 Effect of BBR on viability of podocytes by high glucose at 24 h n=18)

如Fig 6激光共聚焦顯微鏡顯示，與正常對照組相比，desmin的熒光強度明顯升高，與高糖模型組相比，小檗堿(60 μmol·L-1)組可以降低desmin的熒光強度，緩解足細胞的損傷。

2.5 BBR對高糖刺激下足細胞內氧化應激水平及形態學的影響熒光倒置顯微鏡觀察不同組內ROS含量變化的結果顯示，正常對照組中也有ROS的產生，但是含量較少，表明足細胞本身具有一定的ROS生成能力，高糖刺激后，細胞內的ROS明顯增加(P<0.01)，小檗堿(60 μmol·L-1)組可以減弱高糖刺激下足細胞的ROS生成(P<0.01)，見Fig 7A，B。GSH檢測結果表明，高糖模型組的GSH水平比正常對照組低(P<0.01)；與高糖模型組相比，小檗堿(60 μmol·L-1)組則可以明顯上調GSH的水平 (P<0.05)，見Fig 7C。透射電子顯微鏡結果顯示，高糖組線粒體明顯變小伴膜密度增加，線粒體嵴減少。與高糖組相比，小檗堿(60 μmol·L-1)組能明顯改善線粒體的形態變化，見Fig 8。

Fig 4 Effect of BBR on protein expression of Nrf2, HO-1, GPX4 and podocin n=3)

Fig 5 Effect of BBR on mRNA expression of GPX4, PTGS2, ACSL4, Nrf2, HO-1 n=3)

Fig 6 Effect of BBR on positive expression of desmin (n=3)

3 討論

腎小球濾過屏障的破壞是糖尿病腎病進展的主要途徑[8]。腎小球足細胞是高糖作用的靶細胞，足細胞數量的減少會造成腎小球濾過屏障破壞，進而發展成腎小球硬化，腎功能衰竭等癥狀，因此對足細胞的死亡進行干預治療對疾病的發生發展有重要意義。鐵死亡由Dixon等[3]研究Erastin殺死RAS突變得到腫瘤細胞作用機制時發現，主要是細胞內“鐵”依賴脂質氧自由基異常增高、氧化還原穩態失衡而致。胱氨酸-谷氨酸逆向轉運體(系統xc-)的紊亂會導致GPX4失活，脂質氧化物不能經過GPX4催化的谷胱甘肽還原酶反應代謝，繼而發生類似Fenton反應的方式氧化脂質產生大量的活性氧[9]。本次實驗檢測到高糖刺激下鐵死亡標志蛋白GPX4的明顯下調以及ACSL4、PTGS2的明顯升高，透射電子顯微鏡下足細胞線粒體體積縮小，雙層膜密度增加，線粒體嵴減少或消失；足細胞內GSH的耗竭，ROS水平明顯升高等現象，提示可能存在鐵死亡的現象。采用高糖持續性刺激足細胞，探究除凋亡和自噬之外足細胞的死亡方式，發現鐵死亡標志物GPX4、PTGS2及ACSL4的表達量隨著高糖刺激時間的增加而變化，GPX4在24 h時發生顯著性降低，但是在36 h的時候表達恢復正常。原因可能在于自噬與鐵死亡是正向關系[3]，隨著高糖刺激時間的增加，在36 h時，自噬可能被抑制，因此GPX4增加，鐵死亡現象減少。

Fig 7 Effect of BBR on levels of oxidative stress in HG-induced podocytes n=3)

Fig 8 Effect of BBR on morphological changes of HG-induced podocytes (×20 000, n=3)

此次實驗發現了一種不同于凋亡和自噬以外的新的足細胞死亡方式。在高糖環境下，足細胞在24 h鐵死亡較為顯著，隨后鐵死亡逐漸減弱。結合課題組前期[2]已發表研究成果表明高糖刺激足細胞24 h出現一定程度的凋亡，隨著時間的推移，刺激36 h足細胞凋亡更為顯著。分析以上結果，提示在高糖刺激導致足細胞死亡的過程中，細胞并非傳統認識中存在單一的死亡方式，而是多種死亡方式并存，區別在于不同時間段不同細胞死亡方式占據主導地位；另一方面也提示在通過靶向足細胞干預治療糖尿病腎病時，不同時間段需針對細胞發生的主要病理特征選擇有針對性的干預策略，以達到疾病的精準治療目的。

文獻報道，體內活性氧的明顯升高與糖尿病腎病密切相關，通過抗氧化藥物治療，從而逆轉氧化應激對組織造成的損傷，阻止或延緩疾病的發生、發展[10]。當足細胞受到持續性高糖刺激，會產生應激反應，造成體內活性氧的明顯升高，從而對機體造成損傷。此研究中證明隨著高糖刺激時間的增加，GPX4活性會發生明顯降低[11]，從而抑制細胞內脂質過氧化物的清除，使細胞內活性氧堆積。Nrf2是啟動內源性抗氧化反應元件的轉錄因子[12]，受到外界活性氧等刺激下會發生核轉運發揮抗氧化應激能力。Western blot結果顯示，在高糖環境下，BBR可以明顯增加Nrf2的核轉移，激活下游大量的抗氧化酶基因如HO-1和GPX4等的轉錄，進而減少足細胞鐵死亡現象。

綜上所述，BBR抑制足細胞鐵死亡的作用機制可能與Nrf2/HO-1/GPX4信號通路有關，其詳細機制還需近一步實驗加以驗證，后續實驗將通過對Nrf2進行小分子RNA干擾以及構建過表達質粒,并設置鐵死亡抑制劑的方法，對BBR如何調控足細胞鐵死亡的機制進行蛋白和基因水平上更深層次的研究。

(致謝：本實驗完成于中國科學技術大學附屬第一醫院藥劑科藥物基因檢測實驗室，向全體老師和同學們表示感謝。)