SIRT1介導的七氟醚后處理對失血性休克復蘇小鼠學習與記憶損傷的保護作用

黃曉童，黃春霞，胡憲文

(麻醉與圍術期醫學安徽普通高校重點實驗室，安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科，安徽 合肥 230601)

失血性休克是創傷導致患者死亡的重要原因之一，目前通常采用快速灌注液體的方法以迅速恢復循環血容量治療失血性休克。當采取積極措施恢復機體血供時，腦組織因其較為脆弱會受到二次損傷，稱之為腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)。有研究發現丙泊酚通過抑制凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)介導的大鼠全腦的缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)誘導的細胞凋亡，從而減輕CIRI[1]。沉默信息調節因子(silent information regulation 1，SIRT1)參與多種生物代謝活動，如炎癥反應、細胞衰老與凋亡、氧化應激及腫瘤形成等[2-3]。有研究指出，Maresin-1治療通過激活SIRT1信號來減少炎癥反應和線粒體損傷，從而減輕CIRI[4]。我們前期研究結果發現，七氟醚后處理可能通過上調SIRT1和過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)降低氧化應激反應水平，從而對CIRI起到積極的保護作用[5]。然而基于SIRT1通路的七氟醚后處理腦保護作用的具體機制目前尚未有研究。本實驗擬用特異性的SIRT1抑制劑研究SIRT1在七氟醚后處理小鼠失血性休克與復蘇中的作用，以進一步探討七氟醚后處理發揮腦保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物從安徽醫科大學動物實驗中心購買C57BL/6J小鼠(8-10周齡，♂)進行實驗，動物使用許可證號是SYXK(皖)2017-006。

1.2 試劑七氟醚(艾伯維公司，83291)，EX527(美國Sigma公司，E7034-5MG)，TTC染料(美國Sigma公司,T8877)，BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA(碧云天生物技術有限公司，P0012,P0013K),SIRT1抗體(Cell Signaling Technology,9475S)，Bax抗體(Cell Signaling Technology,2772S)，Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology，3498S)，Cleaved-caspase-3抗體(Cell Signaling Technology,9664S)，ECL顯影液(美國Thermo Fisher Scientific公司,32109)，β-actin抗體(中杉金橋生物技術有限公司,TA-09), TUNEL試劑盒(羅氏公司,12156792910)。

1.3 儀器七氟醚蒸發罐(Grager公司)，凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)，多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)，動物行為視頻分析系統(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，RSP01-C單通道雙向推拉注射泵(嘉興貝塔儀器有限公司)，麻醉氣體檢測儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

1.4 動物分組、模型建立及給藥根據隨機數據表法將小鼠分為5組(每組15只):假手術組(Sham組)、失血性休克與復蘇組(Shock組)、七氟醚組(Sevo組)、SIRT1特異性抑制劑EX527+七氟醚組(EX527+Sevo組)、SIRT1特異性抑制劑EX527組(EX527組)。Sham組僅進行右側頸總動脈、頸靜脈置管，不進行抽血。Shock組分離出右頸總動脈和頸靜脈后，分別向近心端置入PE10管。經頸靜脈輸注肝素300 U·kg-1，觀察10 min后，利用輸液泵將小鼠總血容量50%的血液在30 min內經右頸總動脈勻速抽出，抽出的血液存儲于無菌2 mL注射器中。1 h后，將血30 min內回輸，建立失血性休克與復蘇模型。Sevo組先建立失血性休克模型，在回輸血液即刻吸入2.4%七氟醚。小鼠體溫在實驗過程中維持在37 ℃左右。EX527+Sevo組在動靜脈置管前30 min經腹腔注射SIRT1特異性抑制劑EX527 10 mg·kg-1，其余操作同Sevo組。EX527組在動靜脈置管前30min經腹腔注射SIRT1特異性抑制劑EX527 10 mg·kg-1。

1.5 小鼠空間與學習記憶能力測定、逃避潛伏期實驗以及空間探索實驗各組小鼠于術后d 4-10進行水迷宮實驗。將小鼠面向池壁放入水中，放入位置隨機?、?、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個象限之一，在60 s內找到平臺的時間為逃避潛伏期(escape latency period)。動物行為視頻分析系統追蹤小鼠的運動軌跡，記錄小鼠尋找平臺的時間(潛伏期)。每只小鼠每天進行4次訓練，兩次實驗間隔15-20 min，當日成績為4次成績的平均值，連續6 d，實驗于每天14 ∶00-18 ∶00之間進行。另外，觀察小鼠60 s內在目標象限游泳的路程。

1.6 TTC染色水迷宮實驗結束后(術后d 10)取腦組織切片行TTC 染色，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。簡而言之，將腦切片在2%的2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)中染色，并在37 ℃下孵育30 min。然后，將腦切片在4%多聚甲醛中固定24 h。使用光學顯微鏡(Olympus Corporation)捕獲圖像。白色區域為梗死區域，紅色區域為正常區域。計算公式為：梗死體積比例/%=[(梗死面積×2 mm)/(2×全腦面積×2 mm)]×100%。

1.7 TUNEL染色水迷宮實驗結束后(術后d 10)取腦組織做冰凍切片，進行TUNEL染色，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。將冰凍切片放入PBS液中清洗，滲透反應液冰上反應5 min，放入PBS液中清洗，滴加混合反應液后置于37 ℃保溫箱中反應120 min，放入PBS液中清洗，DAB顯色，脫水，封片，各組動物每張切片取海馬CA1區視野，在顯微鏡下觀察TUNEL染色陽性細胞。

1.8 Western blot法水迷宮實驗結束后(術后d 10)，取海馬組織勻漿，于4 ℃下13 200 r·min-1離心30 min，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白含量，取50 μg樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜、封閉、加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日加入二抗，室溫孵育2 h。凝膠成像系統拍照，通過ImageJ軟件測定蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 各組小鼠潛伏期比較如Fig 1所示，從d 5開始，Sevo組和Sham組小鼠的潛伏期明顯短于Shock組(P<0.05)。EX527和Sevo聯合處理可延長小鼠的潛伏期，此外，我們發現Sham組和EX527處理組小鼠的潛伏期差異無顯著性。

Fig 1 Comparison of latency period in five

2.2 各組小鼠目標象限路程比較如Fig 2所示，Sevo組和Sham組小鼠的目標象限路程明顯長于Shock組(P<0.05)，EX527+Sevo組小鼠的目標象限路程較Sevo組相比明顯縮短(P<0.05)，Sham組與EX527組小鼠目標象限時間百分比差異無統計學意義。

2.3 各組小鼠腦梗死體積比較TTC染色實驗結果顯示：Shock組與EX527+Sevo組小鼠的腦梗死體積明顯增加，而Sevo處理后腦梗死體積明顯降低。同時，我們還發現，與單純的Sevo組相比，EX527+Sevo組小鼠腦梗死體積增加(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 2 Comparison of path of crossing originplatform quadrant in each

Fig 3 Effects of sevoflurane postconditioningon infarct size of brain in

2.4 各組小鼠TUNEL染色結果比較TUNEL染色結果顯示：Shock組與EX527+Sevo組小鼠的TUNEL染色陽性細胞增多，而Sevo處理后TUNEL染色陽性細胞減少。同時，與單純的Sevo組相比，EX527+Sevo組小鼠TUNEL染色陽性細胞增多，見Fig 4。

Fig 4 TUNEL staining results of mice in each group(×300)

Fig 5 Effects of sevoflurane postconditioning on expressionof SIRT1 and Bax, Bcl-2,

2.5 SIRT1和凋亡相關蛋白的表達情況我們采用Western blot對各組小鼠腦組織中相關蛋白進行了檢測，結果顯示：與Sham組比較，Shock組SIRT1、抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達降低，而促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)。此外，Sevo組與Shock組相比，小鼠腦組織中SIRT1蛋白表達水平和Bcl-2的表達水平升高(P<0.05)，而Bax、Cleaved-caspase-3表達下降(P<0.05)。

3 討論

CIRI是指缺血腦組織在一定的時間內恢復血供時，不僅沒有恢復正常腦功能，反而加重腦損傷。急性重度失血性休克和再灌注會導致神經元嚴重的損害。CIRI涉及多種機制，如內質網應激反應、興奮性氨基酸/氧自由基、線粒體損傷、鈣超載、炎癥反應、細胞凋亡等[6-7]。有文章提出橄欖苦苷(Oleuropein, OL)通過上調凋亡重要標志物Bcl-2的表達和下調Bax的表達來發揮抗凋亡作用，是一種潛在的腦卒中治療方法[8]，這為我們的實驗設計也提供了思路。Zhang等[9]的研究指出，七氟烷處理可以明顯的改善IRI動物模型后小鼠的記憶和學習功能，這與我們的七氟烷后處理失血性休克復蘇小鼠在Morris水迷宮實驗中的結果一致，其主要表現為小鼠逃避潛伏期明顯縮短，且活動路程減少。同時，我們發現七氟醚后處理可以明顯減少CIRI引起的腦梗死體積，說明七氟醚具有一定的神經保護作用。

SIRT1蛋白在多數生物活動中具有不可或缺的作用。SIRT1介導的信號通路與改善學習記憶、認知功能密切相關。近年來研究表明， SIRT1是細胞內信號轉導網絡的核心靶點，其在調控細胞衰老、細胞凋亡等方面均發揮著重要作用[10]。在局灶性腦缺血中，敲除大鼠SIRT1后，腦梗死面積增大[11]。研究中發現SIRT1可以調控視網膜細胞中的能量代謝，通過抑制IRI后的線粒體損傷，從而對視網膜細胞起到IRI后的保護作用[12]。神經元細胞是完全依靠線粒體提供的ATP來維持其神經活性和功能，因此線粒體功能紊亂程度與神經元細胞損傷程度密切相關[13]。凋亡刺激會導致線粒體內膜上的非特異通道mPTP開放[14]，而mPTP開放則被認為是線粒體功能障礙的最初原因之一[15]。我們發現SIRT1在七氟烷處理之后的小鼠腦組織中的蛋白表達水平明顯提高，此前有研究表明，小鼠IRI手術處理之后的腦組織中SIRT1的表達水平明顯降低[16]，而進一步促進SIRT1的表達則會明顯減輕IRI導致的神經損傷，充分證明了SIRT1參與了七氟烷后處理對失血性休克復蘇小鼠學習與記憶損傷的保護作用。

有研究指出，IRI帶來的炎癥損傷可以明顯促進小鼠神經元的凋亡[10]。在腦缺氧缺血及再灌注過程中，細胞凋亡是神經元受損的主要形式之一，而Bcl-2和Bax是凋亡家族中調控細胞凋亡的兩個主要基因，其中Bcl-2作為典型的抗凋亡蛋白而Bax作為促凋亡蛋白，兩者的異常表達與凋亡調控及凋亡嚴重程度直接相關[17]。在Wang等[7]的研究中發現，SIRT1過表達會抑制PC12細胞在氧糖剝奪復氧(OGD/R)處理之后的Bax表達和caspase-3蛋白的激活。然而在Chai等[11]的研究中發現，SIRT1會促進Bcl-2的表達，從而抑制細胞凋亡。類似的，我們發現IRI之后，SIRT1和Bcl-2的表達水平明顯降低，而Bax和caspase-3的蛋白表達水平明顯提高，說明IRI會明顯促進神經元凋亡，但是進一步使用七氟烷處理則會明顯促進SIRT1的表達而抑制神經元的凋亡，這與之前的文獻報道一致[10]。SIRT1 介導的信號通路起著非常重要的作用，我們進一步使用SIRT1特異性抑制劑EX527抑制七氟烷處理后小鼠中SIRT1的表達，發現小鼠腦組織中的梗死面積又具有明顯的升高，同時，小鼠到達Morris水迷宮平臺的潛伏期明顯增加，且活動路程明顯增加。課題組前期研究發現，七氟醚后處理可能通過激活PI3K-Akt-eNOS信號通路，抑制細胞凋亡，從而減輕CIRI損傷， PI3K/Akt/eNOS是體內細胞信號傳導的常見通路，在調控細胞的周期活動、啟動細胞凋亡、促進新生血管的生成和調節端粒酶的活性等許多方面均發揮了重要作用。我們發現SIRT1可以通過NF-kB信號通路調控PI3K的磷酸化，從而促進Akt/eNOS信號通路的激活，PI3K/Akt通路參與了七氟醚后處理的神經保護作用并已被證明在減輕細胞損傷的機制中發揮關鍵作用，eNOS作為下游分子在維持血管正常功能、血流量以及預防神經細胞損傷方面扮演了重要的功能，并且參與了細胞凋亡的調節，具有抗細胞凋亡作用[18]。本研究結果表明，七氟醚后處理可提高失血性休克復蘇小鼠的學習與記憶能力，減輕IRI損傷所致的腦梗死，增加海馬組織中SIRT1和Bcl-2的表達，減少促凋亡蛋白的表達。與Sevo組相比，EX527+Sevo組小鼠的學習與記憶能力明顯下降，腦梗死體積也明顯增加，而SIRT1與凋亡相關蛋白表達卻無差異，可能是因為實驗周期略長，小鼠體內的EX527被完全代謝，對SIRT1的抑制作用消失甚至出現反跳現象。我們后期會進行急性期的實驗以對本實驗結果進一步驗證。本實驗結果提示，SIRT1可能介導了七氟醚后處理對失血性休克復蘇小鼠的腦保護作用，并通過抑制凋亡發揮作用。