5-氮雜-2′-脫氧胞苷對肺癌SPC-A1細胞增殖及SFRP1、MGMT甲基化蛋白表達的影響

華叢書，葉 靜，陳 海，葛騰飛，陳曉宇

(1.安徽醫科大學胸科臨床醫院，安徽省胸科醫院胸外科，安徽 合肥 230022 ；2.安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，安徽 合肥 230601；3.安徽醫科大學形態實驗中心，安徽 合肥 230032)

肺癌為常見的原發性肺部惡性腫瘤，其發病機制未明。在肺癌發生發展中，Wnt信號通路為保守的信號通路，通過細胞外因子與細胞膜跨膜受體結合，再由胞質連鎖蛋白(β-catenin) 結合，進入細胞核內后，與核內轉錄因子等共同作用，激活靶基因[1]。從細胞生物學水平揭示肺癌的基因表達調控，可提高肺癌早期診療水平[2]。研究表明[3]，在肺腺癌發病中，負調控因子分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled related protein 1，SFRP1)基因啟動子區5′端CpG島的甲基化是導致Wnt信號通路沉默的重要原因。O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)為DNA修復酶，可移除鳥嘌呤O6-甲基的烷化基團，還原鳥嘌呤，防止細胞被烷化劑損傷而惡變[4]。DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)具有與嘧啶類似的結構，可共價結合DNA甲基轉移酶，抑制其酶活性，恢復甲基化的CPG島的抑癌功能[5]。故SFRP1、MGMT基因去甲基化可能在肺癌發病中有一定作用，有望成為潛在的肺癌個體化治療靶點[6]。目前，5-Aza-CdR對肺癌SPC-A1細胞甲基化基因、蛋白和機制影響未明，本研究擬體外觀察5-Aza-CdR對肺癌SPC-A1細胞增殖、細胞遷移和凋亡的影響，探討SFRP1和MGMT甲基化改變，旨在為臨床早期診療肺癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人肺癌細胞株SPC-A1購于中國醫學科學院上海腫瘤細胞庫，本研究室保存并傳代培養。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(批號2352-33-5，上海物競化工)；兔抗人SFRPl多克隆抗體(貨號 ABP55900，英國 Abcam公司)，兔抗人MGMT多克隆抗體(貨號 LS-C205541，美國LSBio)，兔抗人GAPDH多克隆抗體(貨號 SY0636，北京百奧萊博)；DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco生物技術公司)；甲基化特異性PCR試劑盒、TRIzol試劑盒、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(美國Introgen公司)； PCR引物由上海生工生物有限公司合成。BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)；羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗(北京中杉金橋生物技術公司)；青鏈霉素溶液、CCK-8試劑盒、ECL化學發光試劑盒(上海碧云天生物試劑公司)，其他試劑為國產分析純。倒置熒光顯微鏡(Ti2型，日本Nikon公司)；酶標儀(IMARK型，美國BIO-RAD公司)；凝膠成像分析系統(Chemi Doc型，美國BIO-RAD公司)。

1.2 人肺癌細胞株SPC-A1細胞培養和細胞增殖實驗

1.2.1SPC-A1細胞培養 SPC-A1細胞培養于10%胎牛血清的DMEM培養基(內含1%青、鏈霉素雙抗)，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中，每2 d更換液1次，至SPC-A1細胞70%-80%融合時，胰酶消化傳代。

1.2.2CCK-8法檢測不同濃度5-Aza-CdR對SPC-A1細胞增殖的影響 96孔培養板中，每孔加入100 μL的1.0×105個SPC-A1細胞，細胞貼壁后，加藥處理，設不同濃度的5-Aza-CdR處理(0.5、1、3、5、10、30、60、100、200 μmol·L-1)，以不含5-Aza-CdR(0 μmol·L-1)細胞培養液作為對照組，每孔細胞設5個復孔。培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，培養箱中繼續作用4 h。酶標儀(芬蘭雷勃公司)檢測450 nm處測定吸光度(Absorbance，A)值。計算5-Aza-CdR對細胞SPC-A1細胞生長抑制率：細胞生長抑制率/%=(1-給藥組A值/對照組A值)×100%。實驗重復3遍。

1.3 劃痕實驗測定5-Aza-CdR對SPC-A1細胞遷移能力的影響將濃度為1.0×107·L-1的SPC-A1接種于6孔培養板培養24 h，棄去培養基，沿6孔板中軸線，使用微量吸管槍頭在貼壁肺癌SPC-A1細胞表面劃痕，PBS漂洗5 min×3次，去除細胞殘渣，加入含5-Aza-CdR(終濃度0、3、10、30 μmol·L-1)的DMEM培養基，再在CO2培養箱中常規培養48 h，拍照，計算5-Aza-CdR對SPC-A1抑制細胞劃痕愈合率，細胞劃痕愈合率/%=(初始劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.4 Hoechst 33258熒光染色檢測5-Aza-CdR處理后SPC-A1細胞細胞凋亡情況對數生長期的肺癌SPC-A1細胞，1 × 107個·L-1細胞接種于6孔板中，預先在6孔板中放入涂有多聚賴氨酸的蓋玻片。37 ℃、5%CO2培養箱中孵育 24 h，并加入5-Aza-CdR(終濃度為 0、3、10、30 μmol·L-1)，繼續培養 48 h 后，取出蓋玻片，丙酮固定10 min，PBS漂洗10 min ×3次；1% Triton X-100透化10 min，加入5 mg·L-1的Hoechst 33258染液，避光染色10 min，PBS 漂洗10 min×3次，封片，Nikon倒置熒光顯微鏡觀察。

1.5 5-Aza-CdR處理SPC-A1細胞中SFRP1、MGMT mRNA表達SPC-A1細胞按每孔2×105個的密度接種于6孔板中，收集5-Aza-CdR(0、3、10、30 μmol·L-1)處理24 h的細胞，加入TRIzol裂解細胞后收取細胞懸液于1.5 mL EP管中，充分裂解；加入氯仿混勻，4 ℃離心15 min，取上清加異丙醇混勻，4 ℃離心10 min，沉渣加75%乙醇洗滌、離心；加入10 μL DEPC水，冰上溶解，分光光度計檢測RNA濃度和純度。按逆QPS-201轉錄試劑盒說明書反轉錄，Real-time PCR檢測SPC-A1細胞中SFRP1mRNA、MGMT mRNA表達量，以GAPDH mRNA為內參，引物序列如下：SFRP1引物，F 5′-CGA GTTTGCACTGAGGATGA-3′，R 5′-CAGCACAAGCTT CTTCAGGTC-3′； MGMT引物，F 5′-AGTAGGAGGA GCGATGAGGAG-3′，R 5′-AGAAGCCACTCTCTTTCAC ATCT-3′； GAPDH引物，F 5′-AGGTGAAGGTCGGA GTCAACG-3′，R 5′-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3′。PCR反應體系為10 μL、上游、下游引物各 1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。根據2-△△Ct法計算各組相對SFRP1 mRNA、MGMT mRNA相對含量。

1.6 5-Aza-CdR處理SPC-A1細胞中SFRP1、MGMT蛋白表達1 × 107個·L-1對數生長期的SPC-A1細胞接種于6孔板，CO2培養箱中常規培養24 h，加入不同濃度(0、3、10、30 μmol·L-1)的5-Aza-CdR處理24 h，收集細胞，RIPA 裂解液提取總蛋白質，BCA試劑盒定量。30 μg蛋白質上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離、轉膜，兔抗人SFRP1多克隆抗體(1 ∶2 000)、MGMT多克隆抗體(1 ∶1 500)、內參GAPDH(1 ∶2 500)，4 ℃孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h，ECL曝光、定影、顯影。采用ImageJ 軟件分析SFRP1/GAPDH、MGMT/GAPDH相對蛋白定量分析，實驗重復3次，計算平均光密度值。

2 結果

2.1 5-Aza-CdR對SPC-A1細胞增殖的影響5-Aza-CdR作用SPC-A1細胞48 h后，CCK-8法檢測SPC-A1細胞增殖情況，結果如Fig 1所示，與對照組(5-Aza-CdR 0 μmol·L-1)相比，5-Aza-CdR抑制SPC-A1細胞的增殖呈濃度依賴性(P<0.05，P<0.01)，其IC50值為21.2 μmol·L-1。

Fig 1 Effects of different concentrations of 5-Aza-CdR on proliferation of SPC-A1 cells

2.2 不同濃度5-Aza-CdR對細胞劃痕實驗的影響劃痕實驗結果如Fig 2所示，5-Aza-CdR作用48 h后，不同濃度的5-Aza-CdR可抑制肺癌細胞的遷移能力，以對照組(0 μmol·L-1的5-Aza-CdR)為100%計算，濃度為3、10、30 μmol·L-1的5-Aza-CdR對肺癌細胞劃痕愈合分別為(89.4±2.6)%、(73.6±4.2)%、(56.7±4.5)%。

Fig 2 Cell scratch experiments at different concentrations of 5-Aza-CdR for 48 h(×10)

2.3 Hoechst 33258 熒光染色檢測5-Aza-CdR對SPC-A1細胞凋亡情況不同濃度的5-Aza-CdR處理肺癌SPC-A1細胞 48 h后，在熒光顯微鏡下，經紫外光激發，可見5-Aza-CdR(3、10、30 μmol·L-1)出現典型的肺癌SPC-A1細胞凋亡形態學改變，表現為核染色質濃縮、碎裂。而未給5-Aza-CdR的對照組(0 μmol·L-1)細胞核呈較為均勻的藍色熒光，見Fig 3。

Fig 3 Fluorescence staining results of Hoechst 33258 (×200)

2.4 RT-PCR法檢測甲基化mRNA表達情況肺癌SPC-A1細胞RT-PCR檢測發現，與無5-Aza-CdR 作用時相比較，隨著5-Aza-CdR處理濃度的升高，SPC-A1細胞中SFRP1 mRNA、MGMT mRNA呈上升趨勢，且隨著5-Aza-CdR濃度(3、10、30 μmol ·L-1)的升高，SFRP1 mRNA、MGMT mRNA顯著升高，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)，見Fig 4。

Fig 4 Methylated mRNA expression in SPC-A1 cells after 5-Aza-CdR treatment detected by RT-PCR n=3)

2.5 Westernblot法檢測甲基化蛋白表達情況肺癌SPC-A1細胞蛋白免疫印跡檢測發現，無5-Aza-CdR 作用時，SPC-A1細胞中SFRP1、MGMT蛋白呈低表達狀態；隨著5-Aza-CdR處理濃度的升高，SPC-A1細胞中SFRP1、MGMT蛋白呈上升趨勢，見Fig 5A。SFRP1/GAPDH、MGMT/GAPDH相對蛋白圖像掃描半定量統計結果表明，且隨著5-Aza-CdR濃度(3、10、30 μmol·L-1)的升高，SFRP1、MGMT蛋白表達較對照組升高，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)，見Fig 5B。

Fig 5 Effect of methylated protein expression in SPC-A1 cells after 5-Aza-CdR treatment detected by Western blot

3 討論

腫瘤細胞DNA 異常甲基化是一種常見的表觀遺傳學改變，在基因堿基序列沒有改變的情況下，通過堿基序列增減甲基而使基因結構改變，影響癌基因和抑癌基因表達；同時，也為臨床治療腫瘤、改變腫瘤遺傳特性提供一種新的方法[2]。5-Aza-CdR是核苷類甲基化調節物，可以特異性抑制DNA 甲基轉移酶活性，下調細胞周期的S期基因甲基化水平，阻斷細胞甲基化反應，從而抑制腫瘤的生長[7]。本研究通過CCK-8法，檢測5-Aza-CdR對人肺癌SPC-A1細胞生長的影響，結果表明，5-Aza-CdR對肺癌細胞增殖呈抑制作用，且該作用與5-Aza-CdR濃度呈正相關。

抑制腫瘤細胞侵襲轉移和促進腫瘤細胞凋亡是臨床腫瘤化療的基礎，本研究通過5-Aza-CdR作用肺癌SPC-A1細胞24h后，肺癌細胞遷移能力下降，且隨著5-Aza-CdR濃度的增加而增多，提示5-Aza-CdR抑制肺癌細胞增殖活力的機制可能與其抑制肺癌細胞侵襲轉移有關。凋亡形態學改變早期表現為核染色質的結構改變，DNA特異性染料Hoechst 33258通過A-T鍵結合，熒光顯微鏡觀察細胞核可診斷[8]。本研究觀察到Hoechst 33258熒光染色在無5-Aza-CdR作用下，細胞核熒光染色均勻一致，應用5-Aza-CdR后，出現典型的細胞凋亡形態，細胞核染色質濃縮或碎裂，且隨著5-Aza-CdR濃度升高，該現象更加明顯，表明5-Aza-CdR可誘導肺癌SPC-A1細胞凋亡。

肺癌的發生發展進程中，啟動子區DNA甲基化是導致基因失活的重要原因，通過降低基因組甲基化水平或上升基因啟動子區域甲基化，引起基因功能缺失，引起腫瘤發生；若能通過去甲基化抑制劑逆轉啟動子區DNA甲基化異常狀態，則有可能發揮起抑制腫瘤生長的功效[9]。本研究證實，甲基化抑制劑5-Aza-CdR對肺癌SPC-A1細胞增殖有抑制作用。在機制研究中，異常激活的Wnt/β-catenin 信號通路可引起細胞惡變，SFRPs 類是Wnt通路的抑制因子，SFRP1 是SFRPs 家族成員，SFRP1 基因甲基在DNA 甲基轉移酶調控下，把甲基(供體為S-腺苷甲硫氨酸)轉移到胞嘧啶的第5 位碳原子CpG島上，形成5-甲基胞嘧啶，引起SFRP1 表達降低，導致腫瘤的進展和轉移[10]。本課題組前期證實，與癌旁組織比較，NSCLC 組織中SFRP1 基因甲基化率顯著升高，且與腫瘤的分化程度和淋巴結轉移相關[11]。DNA修復酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶(MGMT)可移除鳥嘌呤O6-甲基的烷化基團，使鳥嘌呤還原，避免細胞被烷化劑損傷而產生惡變[4,12]。本實驗采取不同濃度的5-Aza-CdR作用肺癌SPC-A1細胞株，觀察作用前后SFRP1、MGMT表達，結果表明，在無5-Aza-CdR處理時，肺癌SPC-A1細胞中SFRP1、MGMT mRNA和蛋白呈低表達，5-Aza-CdR處理24 h后，去甲基化產物SFRP1、MGMT表達明顯增多，且與5-Aza-CdR濃度相關。進一步證實5-Aza-CdR可激活并上調SFRP1、MGMT mRNA和蛋白表達，從而抑制肺癌SPC-A1細胞生長，具有抗腫瘤效應。

綜上，本研究證實，DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR可抑制肺癌SPC-A1細胞增殖，降低SPC-A1細胞侵襲轉移，促進SPC-A1細胞凋亡，上調去甲基化產物SFRP1、MGMT mRNA和蛋白表達。本研究為將5-Aza-CdR應用于臨床肺癌治療提供一定的理論依據。