布魯菌介導細胞自噬的研究進展

顧國婧，李博文，李文杰，周志雄，羅藝晨，帥學宏，趙 宇，陳吉軒，黃慶洲,伍 莉,焦寒偉

(西南大學 動物科學學院 醫學研究院免疫學研究中心/獸醫科學工程研究中心，重慶 402460 )

布魯菌為球桿形革蘭陰性胞內寄生菌，可侵入宿主細胞引起布魯菌病(簡稱布病，又稱馬爾他熱)。布病對關節、神經、生殖和免疫系統都會造成損害[1]，給人類健康和畜牧業的發展帶來嚴重威脅。自噬是真核生物細胞在自噬相關基因的調控下維持機體生態平衡的一種生理機制，在大多數情況下自噬處于未激活狀態，病原菌入侵或外界環境發生改變會激活自噬。據報道，布魯菌可以抑制宿主細胞的凋亡通路，從而介導自噬，為其在宿主細胞內的生存繁殖創造有利條件。隨著自噬相關研究的深入，布魯菌介導細胞自噬成為探究其致病機制的新熱點。

1 布魯桿菌引發自噬

巨噬細胞是布魯菌的主要宿主，布魯菌侵染巨噬細胞可激活自噬的發生。而在成骨細胞中，牛種布魯菌(Brucellaabortus,B.abortus)對于自噬途徑的激活還參與了成骨細胞功能和骨形成的調節[2]。布魯菌感染會誘導TGF-β1分泌、誘導膠原沉積、抑制mmp-9分泌，從而誘導自噬途徑的激活[3]。有研究表明，羊種布魯菌(Brucellamelitensis,B.melitensis) 16M侵染巨噬細胞后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化率將會提升，自噬途徑隨即被激活；Beclin1是抑制、干擾細胞自噬的關鍵基因，添加該基因后可以抑制細胞自噬的發生，降低B.melitensis16M在宿主細胞中存活和繁殖的能力。因此推測B.melitensis16M可以激活自噬途徑并促進B.melitensis16M在宿主細胞中的存活[4]。B.melitensis16M激活的自噬途徑可以降低布魯菌與溶酶體的融合率，從而減少了B.melitensis16M被溶酶體內水解酶的降解，是自噬有利于B.melitensis16M在宿主細胞內生存繁殖的機制之一。

綜合多個不同的研究結果來看，B.abortus和B.melitensis在復制前可能遵循不同的胞內通路，有的表明B.abortus的轉運和復制與經典的大自噬途徑無關，但有的卻顯示大自噬有利于B.melitensis的存活和復制。還有試驗結果表明，B.abortusS2308和B.melitensis16M菌株都能夠侵襲缺乏ATG5的成纖維細胞并在其中進行復制，而ATG5是典型的大自噬途徑的核心成分，這表明布魯菌的復制并不依賴于經典的大自噬途徑[5]。這種不依賴于ATG5的自噬反應被稱為非典型的自噬。最近的研究表明，非典型自噬途徑在宿主-病原相互作用中起著關鍵作用，并且具有與典型自噬途徑相同的上游調節因子。

吞噬過程中，布魯菌在含有布魯菌的液泡(BCV)內存活，與早期核內體(EE)、晚期核內體(LE)相互作用，并與溶酶體(lysosomes,Lys)部分融合形成eBCV。eBCV促進Ⅳ型病毒分泌系統(type Ⅳ secretion system,T4SS)的誘導，T4SS又傳遞效應蛋白，控制eBCV與ER出口位點(ERES)的相互作用[6]。STARR等[7]研究發現，胞內布魯菌通過形成eBCV從內泡室向ER(endoplasmic reticulum,ER)運輸，并產生一個ER衍生的復制液泡(rBCV)。布魯菌控制eBCV向rBCV的轉化的機制在很大程度上仍不清楚，但rBCV的產生并沒有通過ER和高爾基體之間的依賴于ARF1的囊泡轉運[8]。目前已明確證實，T4SS可以通過病毒基因的突變將eBCVs中相應的細菌突變體隔離，使其無法與ERES相互作用并將eBCV轉化為rBCV[8-11]。相反，在rBCV成熟期間，eBCVs定位于ER出口位點ERES，如果滅活小GTPase Sar1則會抑制rBCV的產生，表明布魯菌阻斷ER的早期分泌途徑，促進eBCV向rBCV轉化[8]。Rab2和GAPDH是形成rBCV和細菌復制所必需的，這也能表明布魯菌改變早期分泌途徑的特定成分以獲得ER結構。細菌的分裂和復制都發生在rBCVs內[10]，這表明細菌會在eBCV中為增殖做好準備。布魯菌在ER中增殖后，rBCV轉換為具有自噬特征的間隔(aBCV)，侵染流程如圖1所示。aBCV具有與成熟的自噬體一致的晚期內質體特征，而不顯示ER標記，所以它們在功能上與rBCVs不同。aBCVs與細菌釋放和細胞間傳播相關，并有助于布魯菌在ER中增殖后完成細胞內周期[7]。

圖1 布魯菌胞內侵染流程[12]

aBCV的形成需要自噬起始蛋白ULK1、Beclin1和ATG14L以及PI3K的活化，而與ATG5、ATG16L1、ATG4B、ATG7無關。另外，還與規范的自噬不同的是，這個過程需要ATG9和WIPI1，但不需要DFCP1。有研究表明eBCV向rBCV的成熟則并不需要自噬起始蛋白ULK1和Beclin1以及自噬延長蛋白ATG5、ATG7、ATG16L1和LC3B[13]。還有研究指出非典型通路依賴于ULK1和Beclin1，但與LC3和ATG7以及ATG5無關[14-15]。在布魯菌感染巨噬細胞的晚期，自噬基因AMPK、ULK3和VPS34的miRNA表達譜發生改變[16]，表明該細菌可能為了形成aBCV而改變了相關自噬基因的表達。袁莎[17]研究發現，16M感染巨噬細胞可促進細胞因子IL-6分泌，IL-6能抑制IFN-γ的產生，達到抑制IFN-γ誘導的典型自噬的目的。綜上所述，細菌可能根據它們在胞內生存復制的不同階段選擇性利用了宿主細胞的自噬相關機制。

2 布魯菌介導細胞自噬相關的重要毒力因子和信號通路

布魯菌主要借助LPS、外膜蛋白、VirB編碼的T4SS、雙組分調控系統等毒力因子的作用得以在宿主細胞中生存、繁殖[18-19]。這些因子是布魯菌能夠侵入宿主細胞并在胞內生存復制的必需因素。

2.1 布魯菌LPS介導細胞自噬研究表明，LPS是布魯菌的主要毒力因子之一[20]。LPS在結構和功能整合中起著關鍵作用，同時也是先天免疫系統的主要靶點[21]。它不僅在引導細菌改變胞內運輸途徑方面發揮著重要作用，還保護細菌免受惡劣的細胞內環境的影響，抑制促炎癥和抗菌宿主反應，并干擾巨噬細胞中的抗原提呈[20]。有研究表明，與大腸桿菌相比，布魯菌LPS的活性及毒力要弱幾百倍[22]，這說明布魯菌LPS屬于非典型的LPS。LPS的O抗原能夠阻礙機體細胞誘發凋亡，避免激活細胞先天性免疫系統。但是，目前研究中發現，布魯菌的LPS只與其在宿主細胞內的生存有關。

2.2 T4SS介導細胞自噬T4SS對布魯菌在宿主細胞內免疫逃避、存活、增殖有著密切的作用。通常情況下，宿主細胞吞噬布魯菌后，隨即形成含有BCV的吞噬小體，與Lys融合后，通過水解酶的作用，就能將布魯菌溶解。但是在T4SS的作用下，布魯菌可以阻止Lys與吞噬小體的結合，從而逃脫降解過程。布魯菌憑借T4SS系統的幫助在胞內轉移，最終到達ER，在T4SS編碼的VirB操縱子表達誘導下產生酸性的BCV，BCV的酸性環境利于布魯菌的生存[23]。

T4SS不僅阻礙了BCV與Lys的融合，同時促進細菌轉運到了ER并衍生出適合布魯菌復制的位點，復制過程中需要ER跨膜蛋白Irela的參與[31]。Irela是一個應激ER的未折疊蛋白反應的傳感器，它也有助于誘導自噬。

表1 布魯菌T4SS效應分子功能

2.3 UPR介導細胞自噬有研究通過非折疊蛋白反應(UPR)的激活，提供了自噬和布魯菌感染之間的潛在聯系[13,28,31-32]。UPR是一種ER應激反應，通過嚴格控制促進ER功能基因的轉錄，來恢復ER應激時的穩態，包括脂質合成、ER相關降解(ERAD)和蛋白質的合成[33]。UPR途徑由3個感受ER應激的ER相關受體控制，即IRE-1α、PERK和ATF6[34]。在一些報道中均表明了UPR過程中自噬的激活是由IRE1-TRAF2-JNK途徑介導的[13,28,35]。自噬在ER應激時也被激活，以恢復內環境平衡和促進細胞存活[35]。

UPR是布魯菌復制所必需的，但目前還不清楚布魯菌感染是否會引發完全的UPR反應。有研究表明B.abortus和豬布魯菌(Brucellasuis,B.suis)只激活IRE1α，后者與宿主細胞對T4SS分泌的感知有關[32]，而B.melitensis通過分泌效應子TcpB觸發UPR的所有3個途徑(IRE1α、PERK和ATF6依賴性通路)來誘導ER應激[28]。包括BspC、BspG、BspH和BspK在內的許多附加效應器在上皮細胞中的表達也會觸發ER應激，這表明布魯菌誘導UPR的機制是復雜的，涉及到很多宿主蛋白[27]。并不是所有的UPR調節蛋白都對細菌的復制很重要，但所有研究都支持IRE1α可以被布魯菌感染激活[28,32,36]。

2.4 IRE1α介導細胞自噬有試驗表明布魯菌感染4 h后在細胞內檢測到IRE1α被激活，表明IRE1α在布魯菌胞內循環的早期發揮作用，其激活需要自噬蛋白ATG9和WIPI。宿主蛋白Yip1A在IRE1α的激活下產生，并與IRE1α結合后磷酸化，觸發XBP-1依賴性轉錄[13]。IRE1α對Yip1A的激活與GTPase-Sar1和COPⅡ-coat復合物亞單位的上調有關，后者是ERES和早期分泌轉運的重要組成部分，是產生rBCV所必需的[8]。COPⅡ成分和GTPase Sar1的上調可能會增強ERES的功能并促進ER囊泡出芽，以促進ER膜的獲得。IRE1α活化可以誘導膜磷脂的合成，從而增加粗糙ER的表面積和體積，而ER膜可被病原體利用以擴大其復制生態位的大小和提高其質量[37-38]。IRE1α可以獨立于其他ER相關信號分子來參與調節自噬。

還有研究結果表明，IRE1-ULK1信號軸被細菌顛覆后會促進其在細胞內的寄生。沿該軸的關鍵信號成分，包括IRE1α、BAK/BAX、ASK1和JNK，以及宿主自噬系統ULK1、ATG9a和Beclin1的缺失或失活會顯著干擾布魯菌的細胞內運輸和復制。IRE1α-ULK1軸上的宿主激酶，包括IRE1α、ASK1、JNK1和/或AMPKα以及ULK1，在病原體感染時也以依賴于IRE1α的方式協同磷酸化[39]。

2.5 Yip1A介導細胞自噬Yip1A被認為在膜轉運中具有多種功能，包括參與ERES處COPⅠ囊泡出芽[40]、囊泡與高爾基膜的連接[41]和不依賴于COPⅠ的逆行囊泡轉運[42]。通過TAGUCHI等[12]的研究可以知道，在布魯菌感染的細胞中，ER衍生液泡在復制的細菌附近形成，Yip1A是一種IRE1活化和ER衍生空泡形成所必需的宿主因子，同時，功能性ERES和COPⅡ囊泡也均參與了布魯菌的細胞內復制。

在感染過程中，布魯菌可能通過分泌系統向宿主細胞的細胞質分泌效應分子來參與觸發IRE1的激活。IRE1分子借助Yip1A在ERES上形成高階配合物，再通過自磷酸化激活，然后觸發ER衍生的自噬空泡的形成。同時，COPⅡ組分Sar1、Sec23和Sec24的上調也促進了液泡的形成。這些液泡會與溶酶體小泡融合。布魯菌可以阻斷UPR誘導的液泡形成過程，并獲得ER衍生膜。

2.6 GTPase Rab 2介導細胞自噬GAPDH和小GTPase Rab 2是布魯菌復制的關鍵酶，定位于囊泡管狀簇(vesicle tubules cluster,VTC)上。GAPDH在宿主細胞內具有多種功能，如參與糖酵解和凋亡[43-44]。小GTPase Rab 2在BCV發生的早期阻止BCV與ER的融合。而Rab 2在布魯菌建立了2次復制生態位后，對其生存也是必要的。當GAPDH和Rab 2的表達被抑制時，布魯菌的復制也會被強烈地抑制。此外，以GDP鎖定的形式來阻斷小GTPase Rab 2也抑制了布魯菌的復制。這些結果表明了GAPDH和小GTPase Rab 2在宿主細胞內布魯菌毒力中的重要作用。GAPDH與小GTPase Rab 2的相互作用還控制了ER和高爾基體之間的囊泡逆行運輸[45]。

最初的研究表明，Rab 2的非活性形式對囊泡從ER到高爾基體的順行運輸有負面影響[46]。最近，Tisdale小組已經證明Rab 2通過向VTCs招募GAPDH來調節蛋白質從高爾基向ER的逆行轉運，從而允許逆行性囊泡的釋放[47-48]。這種逆行運輸需要一個功能性的GAPDH/COPⅠ/Rab 2/PKCi/l復合物。

2.7 miRNA介導細胞自噬Fas-l、Bcl-2、IL-1、IL-3R、Cn和AMPK都參與自噬途徑[49-51]，這些基因都受miRNAs調控。病原菌可以誘導miRNA在細胞中的差異表達，反過來miRNA也可以調節宿主對病原菌的反應。由于NF-κB信號通路調控基因轉錄，LPS可以誘導miRNA的表達，比如miR-146b-5p。miR-146b-5p靶向于Tbc1d14，Tbc1d14與自噬激酶ULK1共定位并相互作用。Tbc1d14的過度表達上調了介導RAW264.7細胞自噬激活的miR-146b-5p，同時還誘導了4個自噬相關基因Iigp1、Irgm1、Trp53inp1和Nrbp2的差異表達[52]。除此以外。在布魯菌感染后，miR-1981在RAW264.7細胞中的表達也會上調。但總的來說miRNAs在布魯菌感染過程中介導自噬的具體作用在很大程度上仍是未知的。

2.8 p38 MAPK通路介導細胞自噬p38 MAPK通路和自噬機制的交叉是布魯菌細胞內生命周期的關鍵組成部分。吞噬小體成熟和細胞內復制都需要p38 MAPK刺激，反過來，p38 MAPK又受細胞內感染的誘導和調控。在BCV沿著內吞途徑成熟后，毒力因子轉位到宿主細胞，刺激p38磷酸化和自噬。在沙林鼠種布魯菌(Brucellaneotomae,B.neotomae)通過內小體運輸的過程中，B.neotomae可能會誘導依賴于VirB4的BCV轉化，這就與p38磷酸化和自噬小體形成相關。MAP激酶的誘導和自噬溶酶體的成熟與rBCV的形成有關，也是在巨噬細胞中形成高效的細胞內復制生態位所必需的。

B.neotomae在整個感染過程中都刺激了p38的磷酸化，并且依賴于p38的激活來實現細胞內的生長。此外，B.neotomae對p38磷酸化的誘導依賴于完整的T4SS，這表明T4SS、p38和細菌胞內生長之間存在聯系。而一些B.abortus、B.melitensis、B.suis也可刺激小鼠巨噬細胞中的p38磷酸化，但并沒有研究它們對于T4SS的依賴性[53]。

2.9 ROS通路介導細胞自噬布魯菌可以通過ROS途徑改變自噬相關基因表達，提高自噬活性。AIR結構域也可以通過ROS信號途徑參與布魯菌促進的NLRP3的炎癥反應和活化[54]。由此可見，ROS與細胞自噬存在著密切的聯系。那么布魯菌是否也會通過ROS這一通路介導吞噬細胞的自噬？有研究人員探索了B.melitensis16M侵染過程中AIR結構域和ROS對小鼠巨噬細胞自噬及炎癥的影響，指出AIR結構域能夠通過ROS通路影響16M侵染，同時也提出干擾AIR結構域能夠促進吞噬小體的成熟，促進自噬的發生；16M侵染細胞引起的自噬對炎癥小體的激活有反向調節作用，達到抑制炎癥反應的作用[55]。布魯菌誘導細胞自噬分泌IL-1β與NLRP3炎性小體的活化有關，而ROS在此過程中也發揮重要的作用。

2.10 PI3K/Akt信號通路介導細胞自噬PI3K/Akt信號通路是重要的細胞信號通路之一，與很多疾病有關。其中，PI3K在細胞中對S型和R型的布魯菌感染有不同的調節作用，而Akt在促進細胞生存、生長、增殖、轉移等方面都起到關鍵作用，PI3K/Akt信號通路與腫瘤的發生發展有著密切的關系[56]，也與一些病毒的生存繁殖密切相關。有試驗指出，布魯菌感染能激活PI3K/Akt信號通路，當該通路被抑制劑和RNA阻斷時，可有效降低布魯菌的存活率，誘導B.melitensis16M介導的細胞凋亡和抑制B.melitensis16M介導的細胞自噬[57]。