大豆異黃酮對壩上長尾雞卵巢功能、生殖激素和肌肉品質的影響

官麗輝，馬旭平，劉海斌，張立永*,關 琛，王志偉

(1.河北北方學院 動物科學技術學院，河北 張家口 075131；2.張家口市畜牧技術推廣站，河北 張家口 075000；3.張家口市第七中學，河北 張家口，075000)

隨著畜牧業的不斷發展，抗生素的不良反應越來越凸顯，尋找綠色安全且高效的飼料添加劑尤為重要。大豆異黃酮屬于植物類雌激素，是大豆生長過程中形成的一種次生代謝產物,是一種生物活性物質，具有劑量小、見效快、不良反應小等優點，有提高蛋白質合成效率，改善胴體品質的優點，易被動物吸收利用，對動物生長性能、繁殖性能、抗氧化功能都有一定的影響，是一種新型的飼料添加劑[1]。蔡娟等[2]在海蘭褐產蛋中期分別添加10，50，100 mg/kg大豆異黃酮，進行了12周的對比試驗，發現產蛋率隨著大豆異黃酮添加量的增加呈現出先提高后降低的趨勢，而蛋白含量和蛋殼強度有了明顯的提高。周玉傳等[3]發現，給紹興蛋鴨飼喂5 mg/kg的大豆異黃酮，結果紹興蛋鴨的產蛋率有了很大的提高。蔡興懷等[4]試驗表明，在小鼠日糧中添加25，50，100 mg/kg的大豆異黃酮，均降低MDA在肝、腎中的含量，提高SOD、GSH-Px在肝、腎組織的活性。據報道，日糧中添加30 mg/kg大豆異黃酮，產蛋雞ND的HI抗體滴度顯著提高[5]。目前，大豆異黃酮作用于家禽卵巢功能和生殖激素的研究較少。

壩上長尾雞是一種蛋、肉兼用型地方品種，通過長期的壩上生活環境飼養，具有很強的耐寒性、耐粗飼和抗病能力強、肉質鮮美等特點[6]。隨著人們物質生活水平提高，對肉的品質問題越來越關注，消費者接受程度決定于肉質的優劣，而雞肉作為重要的肉質來源之一，普遍被人們食用。但目前抗生素類、激素類的濫用，造成雞體內化學物質殘留，給畜牧業經濟造成嚴重影響，更嚴重威脅著人類的健康，所以提高雞肉品質是科研人員的主要目標。憑借獨特的產品品質，壩上長尾雞是唯一入選國家家禽志的河北地方雞品種，極具競爭力，市場發展前景廣闊。本試驗以壩上長尾雞為研究對象，研究大豆異黃酮對壩上長尾雞卵巢功能、生殖激素和肌肉品質的影響，為新型飼料添加劑的開發利用以及地方優良品種的保護和繁育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑大豆異黃酮(4.7-二羥基異黃酮，>99.1%)，黃色粉末，南京松冠生物科技有限公司提供。

1.2 試驗動物試驗選取50周齡左右的健康狀況良好的壩上長尾雞150只，分為5組(Ⅰ～Ⅴ組)，每組3個重復，每個重復10只雞。在基礎日糧中分別添加5，10，15，20，25 mg/kg的大豆異黃酮。各試驗雞之間體質量量差異不顯著。

1.3 試驗日糧試驗雞日糧配制參照壩上長尾雞飼養標準，配制成能量水平基本一致的試驗日糧，日糧配方見表1。

表1 基礎日糧配方及營養水平 %

1.4 試驗動物的飼養管理試驗期間自由采食和飲水，試驗前對雞舍以及雞舍內所有設備進行清洗、消毒，試驗開始后，雞舍保持衛生清潔，其他飼養管理參照養殖場飼養管理模式。

1.5 測定的指標與方法

1.5.1卵巢功能的測定 宰殺壩上長尾雞后摘取卵巢組織，把卵巢快速放到配制好的Davidson's AFA 固定液中，期間更換1次固定液。光鏡下觀察切片,分別用體視顯微鏡觀察并記錄各級卵泡數量。

1.5.2生殖激素指標的測定 選取健康且體質量基本一致的壩上長尾雞，采用靜脈采血法，采集1 mL 靜脈血，2 500 r/min離心分離血清測相關激素指標。血清中LH、FSH 分泌量采用ELISA 法，血清中E2采用放射免疫法；PRL使用酶聯免疫吸附法檢測；P4使用放射免疫吸附法(RIA)。

1.5.3肌肉品質的測定 (1)肌肉物理性狀：在試驗最后1 d從每處理組選取2只雞，采取口腔放血式屠宰，宰后45 min取胸肌，4℃冷凍保存24 h,利用相關儀器測物理性狀指標，所測指標包括肉色、肌肉pH、肌肉系水力、剪切力。(2)肌肉組織學性狀：試驗結束時，在每個重復組抽取3只試驗雞，屠宰后摘取胸肌，冷凍保存，以待備用。用手術刀將其切片，制作厚度為 5 μm，進行常規HE染色，鏡檢，分別測量肌纖維直徑和肌纖維密度，并計算其平均值。(3)肌肉風味物質：肌肉氨基酸測定采用高效液相色譜法。

1.6 數據統計分析采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 大豆異黃酮對壩上長尾雞卵巢功能的影響見圖1。正常初級卵泡、正常次級卵泡在Ⅲ組(15 mg/kg)最高，與低劑量Ⅰ組、Ⅱ組,高劑量Ⅳ組、Ⅴ組差異均不顯著(P>0.05)；閉鎖初級卵泡低劑量組與高劑量組之間差異顯著(P<0.05)；閉鎖次級卵泡Ⅲ組最低與Ⅳ組差異不顯著(P>0.05)，與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅴ組差異均顯著(P<0.05)，分別比Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅴ組降低2.51%,1.55%,1.35%；Ⅲ組的小黃卵泡和大白卵泡數量最高，分別比Ⅰ組高7.76% 和8.43%；Ⅲ組的小黃卵泡與低劑量Ⅰ組、Ⅱ組差異顯著(P<0.05)，與Ⅳ組、Ⅴ組差異不顯著(P>0.05)；Ⅲ組的大白卵泡數與Ⅰ組、Ⅴ組差異顯著(P<0.05)，與Ⅱ組和Ⅳ組差異不顯著(P>0.05)。通過計算，15 mg/kg大豆異黃酮添加組(Ⅲ組)顯著降低小黃卵泡、大白卵泡、各級卵泡的閉鎖率(P<0.05)。卵巢功能各指標在數值上會隨著大豆異黃酮添加量的升高表現出先上升后下降的過程。

圖1 大豆異黃酮對壩上長尾雞卵巢功能的影響

2.2 大豆異黃酮對壩上長尾雞生殖激素的影響見圖2。LH:Ⅲ組最高，與Ⅰ組、Ⅴ組差異顯著(P<0.05)；與Ⅱ組、Ⅳ組差異不顯著(P>0.05)，Ⅰ組、Ⅴ組之間差異顯著(P<0.05)。FSH:Ⅲ組與高劑量Ⅳ組、Ⅴ組差異不顯著(P>0.05)，與低劑量Ⅰ組、Ⅱ組差異顯著(P<0.05)，分別比Ⅰ組高3.33%，比Ⅱ組高2.42%。E2:Ⅲ組最高，與Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅴ組差異都不顯著(P>0.05)，與Ⅰ組差異顯著(P<0.05)，比Ⅰ組高3.19%；PRL:Ⅲ組最高，與高劑量組和低劑量組間差異都不顯著(P>0.05)。P4:Ⅲ組最高，與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅴ組差異均顯著(P<0.05)，與Ⅳ組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 大豆異黃酮對壩上長尾雞生殖激素的影響

2.3 大豆異黃酮對肌肉物理性狀的影響見圖3。在日糧中添加不同劑量的大豆異黃酮后，Ⅲ組紅度a*比Ⅰ組和Ⅴ組分別顯著提高11.12%和9.08%(P<0.05)，Ⅱ組比Ⅰ組提高10.14%；亮度L*和黃度b*各試驗組之間差異均不顯著(P>0.05)，變化無規律性；肌肉pH:Ⅲ組顯著低于Ⅰ組和Ⅱ組，分別降低3.81%和2.14%(P<0.05)；剪切力:Ⅲ組顯著低于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅴ組(P<0.05)。肌肉系水力:Ⅲ組顯著高于Ⅰ組11.9%(P<0.05)，但Ⅲ組與Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅴ組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 大豆異黃酮對肌肉組織學性狀的影響由表2可看出，在日糧中添加大豆異黃酮后，壩上長尾雞胸肌肌纖維直徑各試驗組之間差異不顯著(P>0.05)；肌纖維密度Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組極顯著高于Ⅴ組(P<0.01)，Ⅱ組與Ⅲ組顯著高于Ⅰ組、Ⅳ組和Ⅴ組(P<0.05),Ⅳ組和Ⅴ組之間差異不顯著(P>0.05)，Ⅲ組比Ⅳ組、Ⅴ組分別提高29.20%和36.23%。即添加15 mg/kg的大豆異黃酮后對肌肉的組織學性狀效果最佳。

圖3 大豆異黃酮對肌肉物理性狀的影響

表2 大豆異黃酮對肌肉組織學性狀的影響

2.5 大豆異黃酮對肌肉風味物質的影響從表3可看出，在日糧中添加大豆異黃酮后，必需氨基酸各試組間差異均不顯著(P>0.05)，也無規律性影響；天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸在各組間差異不顯著(P>0.05)，但呈現先升高后降低的規律，且Ⅲ組較高。

表3 大豆異黃酮對肌肉風味物質的影響 %

3 討論

3.1 大豆異黃酮對壩上長尾雞卵巢功能的影響卵巢和輸卵管構成雌禽的生殖系統，卵泡的發育與產蛋性能關系密切[7]，卵巢的健康與否決定著蛋雞繁殖性能的高低，而各級卵泡的閉鎖率以及生殖激素的分泌量又是衡量卵巢是否健康的重要指標。顧歡等[8]試驗證明，給伊莎蛋雞飼喂10 mg/kg大豆異黃酮，試驗數周后產蛋率得到了明顯的提高，卵泡閉鎖率明顯下降從而促使了卵泡的發育。周軼琳等[9]在母雞基礎飼糧中分別添加10 mg/kg和15 mg/kg 大豆異黃酮，試驗28 d，10 mg/kg 大豆異黃酮添加組對各級卵泡的閉鎖率影響不顯著(P>0.05)，而15 mg /kg 大豆異黃酮添加組顯著提高了各級卵泡數量(P<0.05)。曹滿湖等[10]研究表明，大豆異黃酮能顯著提高產蛋后期蛋雞的初級卵泡數量，添加量為15 mg/kg 時極顯著降低小黃卵泡、大白卵泡、次級卵泡的閉鎖率，添加量為10 mg/kg 時對各級卵泡的閉鎖率影響不顯著。在本試驗中，正常初級卵泡和正常次級卵泡的數量在各組間沒有顯著性差異，但中劑量組較高；小黃卵泡和大白卵泡數量也大大增加，各級卵泡的閉鎖率顯著下降(P<0.05)，這可能是適當劑量大豆異黃酮具有雌激素受體激動劑的功能，促使了雌激素和促性腺激素受體mRNA的分泌量增加，從而提高了產蛋率改善了卵泡的發育[11-12]。試驗中卵巢功能各指標在數值上會隨著大豆異黃酮添加量的升高表現出先上升后下降的過程?？赡苁且驗榇蠖巩慄S酮影響畜禽的繁殖性能的關鍵是利用其內源性雌激素水平，過高劑量的大豆異黃酮會與雌激素競爭雌激素受體，起抗雌激素的作用，對壩上長尾雞的卵巢和輸卵管等繁殖器官發育的影響是拮抗而不是促進，該試驗結果建議大豆異黃酮在蛋雞飼料中的添加是有安全限量的。

3.2 大豆異黃酮對壩上長尾雞生殖激素的影響家禽生殖激素的分泌與其生殖機能息息相關，在家禽繁殖過程中，不同的生殖激素會使機體呈現不同的生殖反應，家禽不同的生理階段生殖激素也會呈現出不同形態而各種生殖激素構成了支配生殖機能的內分泌體系，影響整個生殖過程。研究表明，LH對膜細胞的刺激會影響到睪酮和雌二醇的合成，從而影響到卵泡的發育和卵巢的成熟，而FSH作為調控卵泡的主導激素，也影響卵泡發育。E2作為禽類主要的雌性激素，能促進腸道吸收，使血中鈣、磷和蛋白質提高，同時刺激輸卵管生長。血清中的P4具有雙向調節作用，低濃度的P4具有促排卵作用，PRL直接作用于卵巢從而抑制卵泡的發育使禽類出現就巢的現象。周振雷等[13]利用大豆異黃酮對蛋雞生殖激素的影響進行了試驗，結果顯示LH、FSH隨著大豆異黃酮劑量的增加也呈現上升的趨勢，但各組之間差異不顯著(P>0.05)。于尚譽等[14]認為，把5，10，15 mg/kg大豆異黃酮添加在種用雞日糧中，LH分泌量得到了明顯的增加而且呈不斷上升的趨勢。郭曉紅等[15]研究證明，添加大豆異黃酮5～15 mg/kg，雞體內FSH水平有所上升，添加量為5 mg/kg時，明顯有促進作用。彭曼麗等[16]試驗證明，在北京鴨開產前飼糧中加入大豆異黃酮，觀察E2的變化規律，發現開產前13～18 d血漿中E2有上升趨勢，于開產前8 d達到高峰。姜禮文等[17]研究表明，隨著大豆異黃酮添加劑量的不斷增加，蛋雞血清中P4含量呈現不斷降低的趨勢，但各組之間差異均不顯著(P>0.05)。本試驗結果表明，適宜劑量的大豆異黃酮對壩上長尾雞的生殖激素有較好地提高作用，但其對動物各級卵泡的作用尚不明確，可能是家禽性腺類固醇的受體主要存在于垂體和下丘腦，而大豆異黃酮又具有雌激素作用，可以同時對垂體和下丘腦進行調節，所以使促性腺激素水平有了明顯的改變，從而影響了促性腺激素基因的表達與合成，促進卵巢雌激素受體(ER)、促卵泡素受體(FSHR)基因的表達，從而提高動物的繁殖性能。但過高劑量大豆異黃酮使生殖激素下降可能與其植物雌激素的作用效應有關，不同生理狀態下產生的作用不同，大豆異黃酮與機體內源性雌激素爭奪體內雌激素受體，雞體內雌激素水平升高，干擾下丘腦-垂體-性腺軸的內分泌軸，抑制下丘腦的促性腺激素釋放激素，減少生殖激素的合成和分泌，造成畜禽的生殖能力下降[18]。

3.3 大豆異黃酮對壩上長尾雞肌肉物理性狀的影響壩上長尾雞是高寒草原柴雞品種，長期的自然選擇使其耐寒力和抗病力增強，肌肉品質鮮美獨特。肉色是肌肉外觀評定的決定因素之一，肌肉顏色深淺與肌紅蛋白和血紅素鐵的氧化程度有關,多用黃度、亮度、紅度等3種指標測定，肉的褪色與肉中氧化過程速率有關。pH值在一定范圍內越低表示肌肉嫩度越好。系水力的大小是指肌肉組織保持原有水分能力的高低，它影響肉色、風味和嫩度。ALLEN等[19]認為通過系水力、滴水損失對肌肉系水能力進行評價，并且滴水損失與系水力呈負相關，滴水損失越小、系水力越大，肉質越好。剪切力作為決定肉質嫩度的主要因素，是人們對肌肉口感接受程度的指標之一。JIANG等[20]試驗得出，在基礎日糧中添加40 mg/kg的大豆異黃酮略微提高了雞肉系水力，添加 20，40 mg/kg大豆異黃酮對雞肉的 pH 值有顯著影響，使雞肉品質得到改善。PAYNE等[21]研究表明，在基礎日糧中添加大豆異黃酮，Cornish X Plymouth Rock雄性肉雞的胸肌質量與腹脂的質量呈負相關，凈肉率增加。

因此,肉品質特性和肌肉系統的氧化反應鏈緊密相關,大豆異黃酮有雌激素受體活性，對雞體有較好地抗氧化作用，使抗氧化因子和促氧因子之間保持相對平衡。這在本課題組所做的大豆異黃酮對壩上長尾雞抗氧化功能的影響試驗也驗證了這一點，適宜的大豆異黃酮能阻止肌肉中Fe2+氧化成Fe3+,理想劑量能夠保護胸肌肉色的穩定性，在一定劑量下大豆異黃酮系水力能更好保護肌肉細胞膜,防止水分損失，使雞肉的剪切力處于較低值，肉質更嫩。

3.4 大豆異黃酮對壩上長尾雞肌肉組織學性狀的影響肌肉的基本單位由肌纖維組成，肌肉的嫩度主要是由肌纖維存在的狀態所決定的，嫩度通常用肌纖維密度和直徑2個指標去評定。目前，很多試驗得出大豆異黃酮利于肌肉生長，通過降低肌纖維直徑、提高肌肉嫩度，從而改善肌肉品質。劉兆斌[22]把大豆黃酮連續灌服于大鼠，結果發現50 mg/kg大豆黃酮組脂肪細胞直徑大小下降8.78%(P>0.05),脂肪細胞密度上升5.45%(P>0.05)；王玉艷等[23]研究結果顯示，3 mg/kg大豆黃酮與50 mg/kg 半胱胺產生協同作用之后，發現肌纖維直徑變小，明顯改善肉質。

本試驗結果表明，適宜的大豆異黃酮能更好促進肌肉生長，顯著提高肌纖維密度，使肉質更為細嫩。其作用機理可能是大豆異黃酮含有異黃酮類植物雌激素，與體內的雌激素競爭下丘腦與垂體上的雌激素受體，適宜劑量的大豆異黃酮可發揮雌激素的效應，刺激生長、生殖系統，促進體內相關的生長激素如睪酮、生長激素(GH)、胰島素樣生長因子(IGF-I)的產生和釋放，促進蛋白質的消化、吸收，促使肌纖維肥大，增大肌纖維的直徑與密度，進而改善肌肉的嫩度和鮮度；這與本試驗所測的大豆異黃酮對肌肉的物理性狀的結果相一致。

3.5 大豆異黃酮對壩上長尾雞肌肉風味物質的影響壩上長尾雞是極具地方特色的優良雞品種，雞肉營養價值高。肉的風味包括香味和滋味，主要由脂質過氧化和蛋白水解產生的氨基酸、肽類決定[24]。肌肉中總游離氨基酸組分是衡量其營養價值的重要指標之一，一般認為，隨著必需氨基酸含量的增加營養價值也隨之提高，同樣甜鮮味氨基酸含量高的肉質風味更佳。本課題組進行的大豆異黃酮對壩上長尾雞抗氧化的試驗結果也表明，添加大豆異黃酮顯著提高了試雞血漿中GHS-Px、T-SOD和 CAT活性,這些結果表明大豆異黃酮能通過提高抗氧化酶活性加快脂肪酸的氧化，轉化能量為ATP，分解產生大量的肌苷酸，而肌苷酸具有風味特性，是雞肉質鮮味特性的主要物質基礎，所以大豆異黃酮可防止風味物質的流失，對雞肉起到了一定的保鮮作用。本試驗結果表明，大豆異黃酮在促進試驗雞氨基酸增長方面作用不明顯，證明該劑量大豆異黃酮的添加對壩上長尾雞風味特性指標作用不明顯。

綜上所述，從卵泡數目、激素各指標及肌肉品質來看，在飼料中添加大豆異黃酮能顯著提高壩上長尾雞的繁殖性能及肌肉品質，對地方特色品種的開發利用具有深遠的意義。