育雛早期應用氟苯尼考對禽腺病毒感染雛雞病情的影響

孟凡亮，劉蒙昊，宋一諾，張 慧，李 焱，曹龍龍，焦秋林，肖一紅，劉思當*

(1.山東農業大學 動物科技學院 山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室/山東省畜禽疫病防制工程技術研究中心，山東 泰安 271018；2.武漢大學 藥學院，湖北 武漢 430072)

氟苯尼考(florfenicol，FLO)為目前動物專用的廣譜抗菌藥物。該藥最初于20世紀90年代被研發成功，作為氯霉素和甲砜霉素的替代藥物而被廣泛應用于畜禽和水產養殖[1]。該藥進入細菌菌體后可以與其核糖體50S大亞基上的A位點緊密結合并影響肽鏈延伸過程中肽酰轉移酶的轉肽反應，使肽鏈的延長被終止，最終達到抑制細菌蛋白質生成和抗菌的目的[2]。但近年來，其毒副作用開始受到人們的關注且相關報道也越來越多。截至目前，已被報道的FLO的毒副作用包括造血和免疫毒性[3-5]、基因毒性[6]及胚胎毒性[1]等。研究表明，FLO考雖然不會造成機體的再生障礙性貧血，但能夠導致機體較強的免疫抑制。

禽腺病毒(fowl adenovirus，Fadv)是無囊膜的雙股DNA病毒，根據其抗原性的不同，禽腺病毒被分為3個群(Fadv-Ⅰ～Ⅲ)，Ⅰ群禽腺病毒又分為5個亞群(A～E)、12個血清型(Fadv-1～11，其中Fadv-8又分為a和b 2個型)[7-9]。1987年，巴基斯坦的安卡拉第1次發生了心包積液綜合征(HPS)，所以又有“安卡拉病”之稱[10]，該病由Ⅰ群的血清4型禽腺病毒(Fadv-4)所引起，主要病變是心包腔內有清亮或膠胨樣積液和肝臟出血性壞死及形成核內包涵體。之后，HPS在世界各地多有發生的報道，包括韓國[11]、日本[12]、波蘭[13]和匈牙利[14]。自2015年以來，該病在我國暴發流行，使養雞業遭受巨大的經濟損失。

本試驗通過對Fadv-4感染SPF雛雞并應用飲水給藥，監測死亡及排毒情況，并對免疫器官干擾素相關基因及細胞因子基因表達情況進行檢測，綜合評價應用FLO對禽腺病毒感染雛雞病情的影響，進一步認識FLO的毒副作用，為臨床合理使用氟苯尼考提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及主要試劑SPF雞胚及雛雞購自山東省農業科學院家禽所；FLO粉劑(含量≥98%)購自浙江國邦藥業有限公司；TRIzol試劑購自TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司；DMEM培養基購自HyClone公司；胎牛血清 (FBS) 購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、SYBR Green qPCR試劑盒購自東洋紡公司。

1.2 試驗設計將90羽1日齡SPF雛雞隨機分為3組，即對照組、Fadv-4組、Fadv-4+FLO組,每組30只。雛雞3日齡時進行頸部皮下注射攻毒，每只雞107TCID50/0.2 mL，同時用藥組3日齡開始飲水給藥FLO(100 mg/L)，連續給藥5 d。其中,每組10只雞用來統計死亡情況，每天觀察各組雛雞狀態并進行記錄。每組另外20只雞采集泄殖腔棉拭子進行排毒情況檢測，采集脾臟、法氏囊及胸腺3種免疫器官進行免疫器官指數測定及基因表達情況檢測。

1.3 病毒滴度測定選取9日齡雞胚分離原代肝臟細胞，用排槍將消化好并且混勻的100 μL細胞接種于96孔板，待細胞生長至80%時，進行10倍梯度接毒，病毒選用本實驗室前期分離純化的血清4型禽腺病毒，37℃、5%CO2恒溫培養箱培養5 d后，根據Reed -Muench方法計算毒株的TCID50。

1.4 引物設計與合成根據文獻報道，設計合成Fadv引物[15]、管家基因β-actin及目的基因IRF-7、2′-5′OAS、MX1[16]、IFN-γ[17]、IL-6[18]及TNF-α[19]引物，經Blast驗證，初步判定引物具有較好的特異性。引物凍干品由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用前用DEPC處理的滅菌超純水稀釋為10 μmol/L的濃度，分裝后于-20℃冰箱凍存備用。

1.5 樣品核酸提取棉拭子病毒DNA使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA Extraction Kit提取病毒核酸，免疫器官總RNA用TRIzol法進行提取。

1.6 反轉錄及qPCR反轉錄過程參照東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒的說明書操作，qPCR體系參照東洋紡SYBR?Green Real-time PCR Master Mix試劑盒說明書進行。

1.7 數據處理與分析采用SPSS 20.0軟件對試驗數據進行生物統計分析，用GraphPad prism 7.0軟件繪制圖。數據的分析運用ANOVA單因素分析和LSD假定方差齊性分析來進行各試驗組之間的差異性比較，并以P<0.05判定為差異顯著。

2 結果

2.1 不同處理組雛雞死亡情況比較分析結果對3個組的雛雞死亡情況進行統計分析發現，2個攻毒組都是在攻毒后4 d開始出現死亡，攻毒后5 d達到死亡高峰，Fadv-4+FLO組在攻毒后7 d雛雞全部死亡，Fadv-4組最后仍有20%的存活率，對照組全程無死亡情況(圖1A)。對每天的病死率進行統計分析發現，Fadv-4+FLO組每天的病死率基本都顯著高于Fadv-4組(圖1B)。

A.不同組雛雞生存曲線；B.攻毒雛雞病死率。*.P<0.05； **.P<0.01；***.P<0.001。下同

2.2 泄殖腔排毒情況監測結果在攻毒后1～5 d采集2個攻毒組的泄殖腔棉拭子，用qPCR方法對2個攻毒組的排毒情況進行檢測。結果顯示，在攻毒后1～3 d Fadv-4+FLO組的排毒量略低于Fadv-4組，但差異不顯著；攻毒后 4，5 d，即死亡高峰期時，Fadv-4+FLO組的排毒量開始高于Fadv-4組，差異也不顯著(圖2)。

2.3 病理學變化攻毒后5 d對不同組雛雞進行剖檢觀察，可見Fadv-4組(圖3A，B)及Fadv-4+FLO組(圖3D，E)均具有典型的血清4型禽腺病毒感染病變，表現為心包積液及肝臟變性腫脹及出血病變；肝臟組織切片可見肝臟細胞呈現顆粒變性和空泡變性，多見灶狀壞死，并見大量淋巴細胞與巨噬細胞浸潤，肝細胞核內有嗜酸性或嗜堿性包涵體(圖3C，F)，并且Fadv-4+FLO組的病變更加嚴重。

圖2 排毒情況

A～C.Fadv-4組雛雞剖檢及肝臟鏡檢病變；D～F.Fadv-4+FLO組雛雞剖檢及肝臟鏡檢病變

2.4 免疫器官指數比較結果對不同處理組脾臟、法氏囊及胸腺等3種免疫器官的器官指數進行了測定，發現2個攻毒組的脾臟器官指數在攻毒后3 d略低于對照組，但差異不顯著；攻毒后5，7 d，2個攻毒組的脾臟器官指數均高于對照組，但是Fadv-4+FLO組低于Fadv-4組(圖4A)。2個攻毒組的法氏囊器官指數在攻毒后3 d略高于對照組，在攻毒后5，7 d，2個攻毒組顯著低于對照組，并且Fadv-4+FLO組低于Fadv-4組，但差異不顯著(圖4B)。2個攻毒組的胸腺器官指數均低于對照組，并且Fadv-4+FLO組低于Fadv-4組，且在攻毒后7 d時差異顯著(圖4C)。

A.脾臟；B.法氏囊；C.胸腺

2.5 干擾素相關基因表達情況比較分析結果用qRT-PCR的方法對攻毒后5 d 3種免疫器官中的干擾素相關基因表達情況進行了檢測分析，結果顯示在脾臟中Fadv-4+FLO組的IRF-7的表達量顯著低于Fadv-4組及對照組，2個攻毒組2′-5′OAS及MX1的表達量均顯著高于對照組，并且Fadv-4+FLO組低于Fadv-4組(圖5A)；在法氏囊中IRF-7的表達量3個組無明顯差異，2個攻毒組2′-5′OAS及MX1的表達量均顯著高于對照組，并且Fadv-4+FLO組顯著低于Fadv-4組(圖5B)；在胸腺中2個攻毒組IRF-7、2′-5′OAS及MX1的表達量均顯著高于對照組，并且Fadv-4+FLO組IRF-7及2′-5′OAS表達量顯著低于Fadv-4組(圖5C)。

A.脾臟；B.法氏囊；C.胸腺

2.6 細胞因子基因表達情況比較分析結果對攻毒后5 d 3種免疫器官中的細胞因子基因表達情況進行了檢測分析，結果顯示在脾臟中2個攻毒組IL-6及IFN-γ的表達量均顯著高于對照組，并且Fadv-4+FLO組顯著低于Fadv-4組，3個組中TNF-α的表達量無明顯差異(圖6A)；在法氏囊中2個攻毒組IL-6、IFN-γ及TNF-α的表達量均顯著高于對照組，并且Fadv-4+FLO組顯著低于Fadv-4組(圖6B)；在胸腺中2個攻毒組IL-6及IFN-γ的表達量均顯著高于對照組，并且Fadv-4+FLO組IL-6及TNF-α的表達量均顯著低于Fadv-4組(圖6C)。

A.脾臟；B.法氏囊；C.胸腺

3 討論

近年來，隨著FLO在獸醫臨床及水產養殖中被廣泛應用，尤其是作為開口藥被大量用于家禽養殖。關于FLO毒副作用的研究報道也越來越多[1,20-22]，尤其是FLO的免疫毒性被高度關注[23-25]。但是FLO導致的免疫抑制對于病毒感染的影響尚未見報道。2015年開始，HPS的病例在中國不斷出現，呈現大面積暴發[26-28]，禽腺病毒感染已成為養禽業中日益嚴重的問題。本試驗通過構建血清4型禽腺病毒雛雞感染模型，并模擬FLO的臨床用藥，通過檢測相關指標探討FLO用藥對感染禽腺病毒雛雞病情的影響。

本試驗發現，雛雞感染Fadv-4后同時使用FLO可以顯著增加雛雞死亡率，通過監測感染后1～5 d的排毒情況，發現用藥組的排毒量要高于只感染組，并且剖檢病變也更加嚴重。孫芹芹[15]研究發現，感染Fadv-4組的雛雞脾臟器官指數高于對照組，而胸腺及法氏囊器官指數則低于對照組，本試驗結果與其報道相似，并且本試驗發現Fadv-4+FLO組的3種免疫器官指數均低于Fadv-4組，可能與FLO所導致的免疫抑制有關[29-30]，具體機制仍需進一步研究。

病毒侵入機體后，通過誘導Ⅰ和Ⅲ型IFNs激發機體細胞產生成百上千種ISGs，進而發揮抗病毒作用。ISGs所表達的蛋白不僅能夠直接抑制病毒的復制，而且能夠反饋調節IFNs的表達量間接發揮抗病毒作用[31]。許多病毒刺激Ⅰ型IFN系統，激發數以百計的干擾素誘導基因如2′-5′OAS、MX1和PKR以及轉錄調節因子如IRF-7轉錄。據報道，雛雞感染Fadv-4可以使IL-6、TNF-α等細胞因子mRNA表達水平顯著升高[32]。本試驗發現，FLO用藥組免疫器官中干擾素誘導基因IRF-7、2′-5′OAS及MX1和細胞因子基因IL6、IFN-γ及TNF-α的轉錄水平顯著低于只攻毒組。推測用藥組的雛雞高死亡率以及排毒量的增加可能與用藥組抑制了相關干擾素及細胞因子基因的表達有關，但具體機制仍需進一步探討。

本試驗通過對FLO用藥組與攻毒組的臨床相關指標進行檢測分析，發現雛雞應用FLO會導致更嚴重的發病情況，提示臨床雛禽應用FLO時如果有病毒感染的情況，可能會促進相關病毒病的發生，因此在臨床用藥時應充分考慮FLO的免疫抑制作用。本研究進一步認識了FLO的毒副作用，為臨床合理用藥提供了相關數據支持，為進一步對該藥物毒副作用的研究奠定基礎。