靶向沉默CaMKK-AMPK通路對NEFAs介導肝脂損傷的調(diào)控機制

王 爽，任大禹，張睿鍇，楊 威，張冰冰，董志昊，趙瑩瑩，麻芯茹，徐 闖*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學 生命科學技術(shù)學院，黑龍江 大慶 163319)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)已成為在部分發(fā)達國家及我國常發(fā)的一種代謝性疾病[1]，其疾病發(fā)展過程為最初單純的肝脂肪變性到脂肪型肝炎(NASH)，進而轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不⒏渭毎┥踔磷罱K導致失代償性肝病的發(fā)生，對機體健康造成較大威脅及損害。研究表明，患有NASH的患者其肝臟內(nèi)脂肪酸通量出現(xiàn)明顯增加的趨勢[2]。非酯化脂肪酸(NEFA)及其代謝產(chǎn)物是脂質(zhì)毒性的重要介質(zhì)，其通過誘導脂質(zhì)過度積聚從而導致肝細胞脂毒性損傷以及NAFLD發(fā)展[3]。

非酯化脂肪酸(NEFAs)作為某些代謝性疾病中炎癥反應(yīng)的重要誘導因子，參與小鼠的肝脂代謝過程。相關(guān)研究表明，過量的NEFAs會導致肝細胞內(nèi)脂滴積聚、肝腫大和炎癥(脂肪性肝炎)等疾病發(fā)生[4]。甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)作為一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)結(jié)合的非活性前體，是脂肪生成的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在機體內(nèi)具有促進調(diào)節(jié)脂肪酸合成和脂蛋白攝取的功能。在一項有關(guān)大鼠的研究中證明，過量的NEFAs可明顯損害線粒體的呼吸鏈進而增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生[3]。ROS作為氧化應(yīng)激的標志物能夠引起脂質(zhì)過氧化的發(fā)生并引起炎癥。

AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在真核細胞的細胞能量平衡中起著重要作用[5],除維持細胞內(nèi)能量平衡外，AMPK還調(diào)節(jié)全身能量代謝，參與機體多項生命活動調(diào)節(jié)。相關(guān)研究表明，AMPK調(diào)節(jié)全身能量代謝是通過抑制膽固醇和脂肪酸的合成這一途徑來完成的。因此，其在代謝綜合征等相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(CaMKK)作為AMPK上游激活和調(diào)控的重要因子，調(diào)節(jié)多種生理及病理生理過程[6]。但是針對于在高NEFAs狀態(tài)下CaMKK通過AMPK途徑對機體相關(guān)影響的研究較少，因此本試驗采用添加NEFAs刺激小鼠肝細胞并通過RNA靶向沉默CaMKK來探究CaMKK在高NEFAs狀態(tài)下通過AMPK信號通路調(diào)控下游基因?qū)π∈笱趸瘧?yīng)激、脂滴形成以及肝脂沉積等肝脂損傷過程的影響，為臨床中某些肝臟代謝障礙或異常的疾病提供一定的研究方向及治療思路。

1 材料與方法

1.1 細胞試驗中所用的細胞為小鼠肝細胞系A(chǔ)ML12細胞，購自中國科學院細胞庫，保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學生物技術(shù)中心216室。

1.2 主要試劑及藥品NEFAs購自Sigma公司；DMEM高糖含丙酮酸鈉干粉培養(yǎng)基、青鏈霉素均購自Gibco公司；胎牛血清購自Clark公司；胰酶、PBS、BSA均購自Biosharp公司；ROS含量測定試劑盒購自北京普利萊公司；AMPK、SREBP1、β-actin抗體購自CST公司；HRP標記二抗、顯影發(fā)光液均購自碧云天公司；Bodipy 493/503熒光染料購自Invitrogen公司；CaMKK siRNA購自上海Gene Pharma有限公司。

1.3 AML12細胞的培養(yǎng)與處理AML12細胞接種于6孔培養(yǎng)板106/孔，使用DMEM高糖培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青鏈霉素、1% ITS液體培養(yǎng)基補充劑、40 μg/L地塞米松)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。將生長狀態(tài)良好的AML12細胞分為空白對照組、siCaMKK組、NEFAs組、siCaMKK+NEFAs組，共4組，置于無血清無青鏈霉素培養(yǎng)基中孵育2 h，各組加入不含青鏈霉素的2%BSA培養(yǎng)基培養(yǎng)。siCaMKK組及siCaMKK+NEFAs組用30 nmol/L小鼠CaMKK siRNA根據(jù)制造商的方案使用siRNA-Mate轉(zhuǎn)染試劑分別培養(yǎng)24,12 h后在siCaMKK+NEFAs組和已在不含青鏈霉素的2%BSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h的NEFAs組中加入使用RPMI-1640堿性培養(yǎng)基稀釋的濃度為1.2 mmol/L 的NEFAs培養(yǎng)12 h后收取各組細胞。

1.4 AML12細胞中AMPK、SREBP1水平檢測收取細胞加入含有1%蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液RIPA，漩渦振蕩數(shù)秒后，置于冰上10 min后重復漩渦振蕩操作數(shù)秒，重復上述操作3次。使其裂解充分后4℃、14 000 r/min離心10 min后取上清，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度并進行蛋白定量。蛋白樣品與上樣緩沖液以4∶1的比例混合，經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，利用濕轉(zhuǎn)法以100 V恒壓置于電轉(zhuǎn)緩沖液中電轉(zhuǎn)60 min。將帶有蛋白條帶的PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉1 h。分別孵育多克隆AMPK、SREBP1一抗4℃過夜。孵育結(jié)束后使用TBST(Tris緩沖液，pH7.5，0.1%Tween 20)搖床洗滌3次，5 min/次。隨后利用相應(yīng)兔二抗及鼠二抗室溫孵育1 h后回收二抗，使用TBST于搖床上清洗5次，10 min/次。利用Protein Simpie System進行顯影檢測，使用Image Lab軟件分析比較不同處理后各蛋白的表達量變化情況。

1.5 AML12細胞中ROS水平的檢測按1.3中方法將各組細胞處理完畢后，胰酶消化細胞，用含10 μmol/L DCFH-DA熒光探針的無血清無青鏈霉素培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光染色20 min，加入改良臺式液后1 500 r/min離心5 min，清洗2次后，利用流式細胞儀上機檢測。

1.6 脂滴染色將AML12細胞接種于細胞爬片上，控制細胞接種密度為2×105～4×105/孔。按1.3中描述方法處理細胞后棄上清，PBS緩沖液去除殘留培養(yǎng)基，PBS吸除干凈后利用4%多聚甲醛固定30 min；PBS緩沖液沖洗3次，Bodipy493/503染料避光染色30 min；PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次。之后使用Hoechst染料避光染色8 min，PBS緩沖液沖洗3次，甘油封片后利用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件，運用One-way ANOVA檢測方法進行顯著性分析，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 siCaMKK對NEFAs刺激AML12細胞AMPK、SREBP1蛋白表達的影響結(jié)果見圖1，NEFAs組AMPK蛋白表達水平極顯著低于空白對照組，SREBP1蛋白表達水平極顯著高于空白對照組。siCaMKK組及siCaMKK+NEFAs組AMPK蛋白表達水平極顯著低于空白對照組，SREBP1蛋白表達水平極顯著高于空白對照組。siCaMKK組AMPK蛋白表達水平極顯著高于NEFAs組，而siCaMKK+NEFAs組AMPK蛋白表達水平極顯著低于NEFAs組。siCaMKK組及siCaMKK+NEFAs組SREBP1蛋白表達水平均極顯著高于NEFAs組。

A.Western blot 結(jié)果；B.AMPK相對表達水平；C.SREBP1相對表達水平。*示與空白對照組相比P<0.05，**示與空白對照組相比P<0.01；#示與NEFAs組相比P<0.05，##示與NEFAs組相比P<0.01。下同

2.2 siCaMKK對AML12 細胞ROS含量的影響結(jié)果見圖2，NEFAs組、siCaMKK組ROS水平較空白對照組顯著升高且siCaMKK+NEFAs組ROS水平極顯著的高于空白對照組。siCaMKK+NEFAs組ROS水平極顯著的高于NEFAs組。

2.3 siCaMKK對AML12 細胞脂滴的影響結(jié)果見圖3，NEFAs組及siCaMKK組脂滴較空白對照組增多，且siCaMKK+NEFAs組脂滴數(shù)量明顯多于其他各組。

A.流式細胞圖；B.柱狀圖

圖3 RNA靶向沉默CaMKK對NEFAs刺激AML12細胞脂滴的影響

3 討論

NAFLD多由過量攝入或血液大量NEFAs進入肝臟，導致甘油三酯蓄積所致，肝脂蓄積對肝臟及其他組織造成嚴重損傷，并增加了機體患糖尿病、心血管疾病的風險[7]。本試驗通過添加濃度為1.2 mmol/L NEFAs刺激AML12細胞，檢測SREBP1蛋白水平、脂滴特征，顯示高濃度的NEFAs可導致肝細胞脂肪酸從頭合成水平升高，進而導致肝脂蓄積。同時通過檢測AMPK蛋白表達水平，表明高濃度NEFAs的刺激可導致肝細胞AMPK蛋白表達水平明顯降低。AMPK對代謝的影響包括抑制合成代謝以及刺激分解代謝兩部分。其刺激分解代謝過程均可通過刺激脂肪酶釋放脂肪酸，進一步促進游離脂肪酸進入線粒體進行β-氧化，從而促進脂肪分解[8]。CaMKK作為確定的AMPK級聯(lián)反應(yīng)上游激酶，本試驗通過RNA靶向沉默CaMKK降低AMPK表達水平，結(jié)果顯示siCaMKK加重了小鼠肝細胞肝脂蓄積，同時SREBP1蛋白表達水平升高，表明AMPK可能通過調(diào)控SREBP1進而調(diào)節(jié)肝脂代謝過程。

線粒體作為細胞的動力，在脂肪酸(FA)和葡萄糖等代謝物的最終氧化中起關(guān)鍵作用。研究表明大量脂肪酸進入線粒體，使線粒體內(nèi)的脂質(zhì)過量導致部分氧化的?；鈮A積累，線粒體過氧化氫(H2O2)排放增加，這表明肝細胞脂質(zhì)氧化水平較高[9]，導致ROS水平升高。另一方面，大量脂肪酸從頭合成導致肝脂蓄積，進而加重脂質(zhì)過氧化水平，導致線粒體功能損傷以及ROS水平升高[10]。本研究通過RNA靶向沉默CaMKK降低AMPK表達水平后ROS水平顯著高于NEFAs組，高濃度的NEFAs作用下肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和合成同時增加，肝細胞主要通過肝脂蓄積的形式儲存過量的脂肪酸，進而相對減弱線粒體脂質(zhì)過氧化水平從而減少肝脂損傷。

綜上所述，CaMKK基因可通過AMPK信號通路調(diào)控SREBP1參與并調(diào)節(jié)細胞脂質(zhì)代謝過程，并通過線粒體途徑調(diào)節(jié)肝細胞在高濃度NEFAs刺激狀態(tài)下的氧化應(yīng)激過程，減少肝脂損傷。因此，本試驗提示可以通過調(diào)控CaMKK調(diào)節(jié)細胞氧化應(yīng)激、脂沉積等生物過程，以降低高濃度NEFAs刺激對AML12細胞的損傷。