YAP對梅花鹿鹿茸間充質細胞增殖與分化的影響

張 靜，柳 舒，黃吉成，岳占碰，楊占清，郭 斌

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

鹿茸角是哺乳動物唯一失去后可完全再生的附屬器官，可年周期性的脫落和再生。在快速生長期，鹿茸角的生長速度遠超過癌細胞的增殖速度，可達2.75 cm/d，但卻能精確調控而不發生癌變，因此是研究創傷修復及器官再生的理想動物模型[1]。在鹿茸角生長過程中，各種細胞不斷增殖與分化，處在一個動態平衡中，維持著鹿茸角的生長發育[2]。

YAP (Yes-associated protein，即yes相關蛋白)是Hippo信號通路中的關鍵效應因子，可促進細胞生長并抑制細胞凋亡[3]。在小鼠胚胎干細胞中，YAP高表達有助于促進干細胞增殖并保持未分化狀態[4]。在小鼠間充質干細胞中，YAP過表達可抑制其向軟骨細胞分化[5]。然而，有關YAP對鹿茸間充質細胞增殖與分化的影響，目前尚未見報道。活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 在多種生命過程中扮演重要的角色，如細胞增殖、分化、凋亡、壞死等。當機體內過量的ROS不能被及時清除時就會導致氧化應激[6]。有研究表明，ROS能夠影響干細胞的分化，抗氧化劑治療可抑制間充質干細胞和造血干細胞分化為功能細胞[7]。但有關YAP對鹿茸間充質細胞中ROS水平的影響目前尚不清楚。

本試驗以梅花鹿為研究對象，分離培養鹿茸間充質細胞，添加YAP抑制劑Verteporfin，采用流式細胞術、熒光定量PCR等方法，研究YAP對鹿茸間充質細胞增殖與分化的影響，并探討其調節機理，研究結果將為進一步探明鹿茸角發育與再生的分子機理、充分開發和利用我國的梅花鹿鹿茸資源等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物試驗所用2～3歲的雄性梅花鹿取自長春市世友梅花鹿養殖場，割取生長約60 d的茸角用于試驗。

1.2 主要試劑胰蛋白酶(Amresco公司產品)；PI/RNase Staining Buffer(BD Biosciences公司產品)；Ⅰ型膠原酶(Gibco公司產品)；DMEM/ HIGH GLUCOSE培養基(HyClone公司產品)；胎牛血清(Clark公司產品)；熒光定量試劑盒(Roche公司產品)；MitoSOXTM紅色熒光染料(Invitrogen公司產品)；Verteporfin(R&D Systems)；BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、超氧化物陰離子熒光探針(Dihydroethidium,DHE)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)購自碧云天生物公司。

1.3 鹿茸間充質細胞的分離培養取鹿茸尖端長約5 cm的鹿茸組織，75%酒精消毒，置入添加雙抗的PBS中清洗，在超凈臺分離鹿茸間充質組織，切成碎塊，用不含血清的DMEM高糖培養基清洗，加入Ⅰ型膠原酶消化、離心后，獲取鹿茸間充質細胞，將其放于37℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.4 EdU檢測細胞增殖鹿茸間充質細胞經Verteporfin處理36 h后，于10 μmol/L EdU中孵育2 h；去除培養液，經4%多聚甲醛固定、洗滌后，于含0.3% TritonX-100的PBS中室溫孵育15 min；添加Click Additive Solution，通過流式細胞儀檢測細胞的增殖活性。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期鹿茸間充質細胞經血清饑餓后與Verteporfin孵育36 h，將細胞消化并1 200 r/min離心，棄上清，PBS重懸細胞后，4℃固定于70%冰乙醇，經 PI/RNase染色緩沖液染色15 min，通過流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.6 熒光定量PCR根據NCBI中相關基因序列設計引物(表1)，提取細胞總RNA并進行反轉錄，在LightCycler?96熒光定量PCR儀中進行PCR反應。

1.7 ROS的檢測細胞內ROS水平按照碧云天活性氧檢測試劑盒說明書進行測定。

1.8 超氧陰離子的檢測細胞中超氧陰離子水平通過碧云天超氧化物陰離子熒光探針進行測定，按照說明書步驟操作。

1.9 細胞線粒體中ROS的檢測MitoSOXTM紅色熒光染料具有活細胞滲透性，可快速靶向線粒體，高度選擇性地檢測活細胞線粒體中的超氧化物，進入線粒體后，可被氧化并顯示紅色熒光。參照試劑盒說明書檢測細胞線粒體中ROS水平。

1.10 數據統計分析試驗數據表示為平均值±標準誤，用SPSS 19.0軟件包進行數據處理。單因素方差分析(ANOVA)用于比較不同組的平均值。兩組之間比較用t檢驗，P<0.05為顯著性差異。

表1 PCR引物序列及產物片段大小

2 結果

2.1 YAP對鹿茸間充質細胞增殖的影響為了檢測YAP對細胞增殖的影響，鹿茸間充質細胞血清饑餓后添加YAP抑制劑Verteporfin作用36 h，通過流式細胞術檢測細胞的增殖活性。結果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后可顯著抑制鹿茸間充質細胞的增殖(圖1)。

2.2 YAP對鹿茸間充質細胞增殖周期的影響為了研究YAP對細胞增殖周期的影響，鹿茸間充質細胞經血清饑餓后，與YAP抑制劑Verteporfin孵育36 h，PI染色后，通過流式細胞儀檢測。結果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后鹿茸間充質細胞滯留在G0/G1期，導致G0/G1期細胞數量增多，S期細胞數量明顯減少(圖2)。

2.3 YAP對細胞周期蛋白及蛋白激酶在鹿茸間充質細胞中表達的影響有研究證實，細胞周期蛋白及蛋白激酶與細胞增殖周期進程密切相關[8]。本試驗應用熒光定量PCR方法檢測了Verteporfin對細胞周期蛋白CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1以及細胞周期蛋白激酶CDK2、CDK4、CDK6表達的影響。結果顯示，與對照組相比，Verteporfin可顯著降低CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6在鹿茸間充質細胞中的表達(圖3)。

2.4 YAP對鹿茸間充質細胞分化的影響為了研究YAP對鹿茸間充質細胞分化的影響，將分離培養的間充質細胞與含有YAP抑制劑Verteporfin的間充質干細胞成軟骨誘導分化完全培養基孵育12，24，36，48，72 h后，通過熒光定量PCR檢測了軟骨細胞標志性分子COLⅡ、SOX9和AGC表達的變化。結果顯示，與對照組相比，Verteporfin顯著提高了COLⅡ、SOX9和AGC mRNA水平，并且隨著時間的增加，COLⅡ、SOX9和AGC的表達量也在增加(圖4)。

2.5 YAP對鹿茸間充質細胞中ROS含量的影響ROS可參與細胞中的信號傳導，進而影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程[9]。為了研究YAP對間充質細胞中ROS含量的影響，分離培養鹿茸間充質細胞后，添加Verteporfin作用24 h，裝載熒光探針DCFH-DA，通過流式細胞術檢測細胞中ROS含量的變化。結果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后間充質細胞中ROS的含量顯著上升(圖5)。

A.流式細胞圖；B.YAP對鹿茸間充質細胞增殖的影響柱狀圖。*P<0.05；DMSO.對照組；VCR.試驗組。下同

A.流式細胞圖；B.YAP對鹿茸間充質細胞細胞周期的影響柱狀圖

A.Verteporfin對細胞周期蛋白CCND1、CCND2、CCND3和CCNE1表達的影響；B.Verteporfin對細胞周期蛋白激酶CDK2、CDK4和CDK6表達的影響

A.YAP對間充質細胞中COLⅡ表達的影響；B.YAP對間充質細胞中SOX9表達的影響；C.YAP對間充質細胞中AGC表達的影響

A.流式細胞圖；B.YAP對鹿茸間充質細胞中ROS含量的影響柱狀圖

2.6 YAP對鹿茸間充質細胞中超氧陰離子的影響超氧陰離子(O2-)是細胞中主要的ROS，可與其他酶相互作用，產生其他的ROS[10]。為了研究YAP對間充質細胞中O2-含量的影響，添加Verteporfin作用24 h后，裝載熒光探針Dihydroethidium，通過流式細胞術檢測細胞中O2-含量的變化。結果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后間充質細胞中O2-含量顯著升高，與ROS的變化趨勢一致(圖6)。

A.流式細胞圖；B.YAP對鹿茸間充質細胞中O2-的影響柱狀圖

2.7 YAP對鹿茸間充質細胞中線粒體ROS的影響ROS的主要來源之一是線粒體，稱為線粒體ROS(mitochondrial ROS,mtROS)[11]。為了研究YAP對間充質細胞中mtROS含量的影響，添加Verteporfin作用24 h，與MitoSOXTM紅色熒光染料孵育后，通過流式細胞術檢測mtROS含量的變化。結果顯示，與對照組相比，添加Verteporfin后間充質細胞中mtROS的含量顯著上升(圖7)。

A.流式細胞圖；B.YAP對鹿茸間充質細胞中mtROS的影響柱狀圖

2.8 YAP可通過ROS來調節鹿茸間充質細胞的分化GSH和NAC是常用的抗氧化劑，可清除細胞中的ROS[12]。為了研究YAP是否可通過ROS來調節鹿茸間充質細胞的分化，先用YAP抑制劑Verteporfin處理間充質細胞2 h后，再分別添加GSH和NAC作用24 h，通過實時熒光定量PCR檢測軟骨細胞標志性分子COLⅡ、SOX9、AGC表達的變化。結果顯示，GSH和NAC可顯著降低COLⅡ、SOX9和AGC mRNA在Verteporfin處理鹿茸間充質細胞中的表達(圖8)。

3 討論

鹿茸角是哺乳動物唯一在失去后可完全再生的附屬器官，鹿茸角的再生是基于干細胞的增殖與分化過程。眾所周知，鹿茸角的生長中心位于其頂端。鹿茸角的快速生長主要是通過保留在間充質層中的細胞增殖來實現的，一些細胞傳導途徑和細胞因子參與了鹿茸角的再生過程[13]。

A.NAC減弱Verteporfin對間充質細胞分化的影響；B.GSH減弱Verteporfin對間充質細胞分化的影響

細胞增殖、凋亡和分化之間的平衡對于準確地形成和維持組織器官至關重要。Hippo信號通路在器官發育、腫瘤發生、組織再生和干細胞自我更新中發揮重要的作用[14]。YAP是Hippo信號通路中的轉錄共激活因子，當YAP活躍時，可進入細胞核，與TEAD轉錄因子家族結合，誘導涉及細胞增殖、存活和遷移的多種基因的表達[15]。但是，YAP對鹿茸間充質細胞增殖與分化的影響尚不明確。因此，本試驗以梅花鹿為研究對象，通過流式細胞術和熒光定量PCR等方法研究了YAP對鹿茸間充質細胞增殖與分化的影響。

為了研究YAP對鹿茸間充質細胞增殖的影響，通過EdU法檢測了間充質細胞的增殖情況，結果顯示Verteporfin抑制了間充質細胞的增殖。細胞的增殖過程分為以下4個階段： G1期、S期、G2期和M期。參與細胞周期調節的關鍵機制能夠協調細胞增殖過程。調節該機制的關鍵成分是細胞周期蛋白，它們可結合并激活細胞周期蛋白依賴性激酶并向細胞周期蛋白依賴性激酶提供底物，從而促進細胞的增殖[16]。為了進一步證實YAP對鹿茸間充質細胞增殖的影響，在鹿茸間充質細胞中添加Verteporfin，通過流式細胞術檢測間充質細胞細胞周期的變化，同時通過熒光定量PCR檢測CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6的表達水平。結果顯示，Verteporfin處理后間充質細胞G0/G1期細胞數量增多，S期細胞數量明顯減少。CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6 mRNA水平也顯著下降。這進一步證實了Verteporfin對鹿茸間充質細胞增殖有抑制作用。最近的研究表明，YAP是小鼠間充質干細胞成軟骨細胞分化的負性調控因子，YAP過表達會抑制其向軟骨細胞分化[5]。為了研究YAP對鹿茸間充質細胞分化的影響，在鹿茸間充質細胞中添加Verteporfin處理12，24，36，48，72 h，通過熒光定量PCR檢測了軟骨細胞的標志性分子COLⅡ、SOX9和AGC的表達水平。結果顯示，添加Verteporfin后間充質細胞中COLⅡ、SOX9和AGC mRNA水平均顯著上升，72 h時表達水平最高。這與已有研究結果相一致。

目前，對于氧化應激的研究越來越多。研究發現，Hippo/YAP通路與氧化還原穩態的調節有關，在特異性缺失YAP的小鼠心臟中ROS的含量升高[17]。但是，在SCC(肺鱗狀細胞癌)中，YAP激活會導致ROS積累升高。為了探究YAP對鹿茸間充質細胞中ROS含量的影響，在間充質細胞中添加Verteporfin后，通過流式細胞術檢測間充質細胞中ROS的含量。結果顯示，添加Verteporfin后，與對照組相比，間充質細胞中ROS含量升高。O2-是組成ROS的主要成分[18]，通過流式細胞術檢測了間充質細胞中O2-的含量。結果顯示，添加Verteporfin后，間充質細胞中O2-含量升高，與ROS變化趨勢一致。線粒體是ROS的重要來源[19]，通過流式細胞術檢測了間充質細胞中mtROS的含量。結果顯示，添加Verteporfin后，間充質細胞中mtROS含量升高，進一步明確了YAP對間充質細胞中ROS的作用。ROS是能對細胞生物分子造成氧化損傷的反應性物質，同時ROS還充當細胞信號轉導的第二信使以介導細胞氧化還原信號傳導，從而產生特定的生理反應[9]。為了研究ROS與間充質細胞分化間的關系，在添加Verteporfin后，又添加了抗氧化劑GSH和NAC，通過熒光定量PCR檢測了間充質細胞中COLⅡ、SOX9和AGC mRNA水平變化。結果顯示，添加GSH和NAC后，Verteporfin處理的間充質細胞中COLⅡ、SOX9和AGC mRNA水平顯著降低,這說明YAP可通過ROS來調節鹿茸間充質細胞的分化。

綜上所述，YAP可促進鹿茸間充質細胞的增殖，抑制其向軟骨細胞分化，進而參與梅花鹿茸角的再生。