外泌體介導PCV2通過Toll7/8/9-MyD88-NF-κB信號通路誘導淋巴細胞分泌IL-10

段滇寧，李 鳳，方婷婷，林毓婷，朱艷妍，楊小燕 ,2*，陳洪博,2*

(1.龍巖學院 生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.福建省預防獸醫學與獸醫生物技術重點實驗室，福建 龍巖 364012)

豬圓環病毒2型(PCV2)是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)的主要病因，受PMWS影響的仔豬更容易與其他疾病出現混合感染，如豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病和豬瘟等[1-3]，對我國養豬業造成巨大威脅。越來越多的研究表明，PCV2是一種免疫抑制病毒，可抑制淋巴細胞的轉化能力，并導致淋巴小結內的淋巴細胞凋亡，造成淋巴結內淋巴細胞嚴重缺失[4-5]，使機體呈現免疫抑制狀態。研究表明，PCV2感染可提高IL-10的表達量，IL-10是一種Th2型細胞因子，由活化的淋巴細胞、單核細胞等分泌，能夠抑制Th1細胞的IL-2和IFN-γ的合成，誘導機體出現免疫抑制[6-7]。機體內IL-10表達量升高具有有效的抗炎活性，能降低機體對病毒清除能力[8]。

對PCV2感染的仔豬血清檢測發現，IL-10水平顯著升高，IL-10表達升高主要與T細胞有關，但與B細胞或巨噬細胞關系不大。在淋巴組織中IL-10的表達主要集中在T細胞區域，而在B細胞區域較少表達，如下頜淋巴結、脾臟和扁桃體，在PCV2感染的細胞中表達量低[9]。PCV2的靶細胞主要是巨噬細胞、上皮樣細胞等，那么PCV2是如何誘導淋巴細胞產生IL-10呢，其中的調控機制尚不清楚。本試驗擬以感染PCV2的PK-15細胞所產生的外泌體為研究對象，研究其對體外培養的仔豬淋巴細胞分泌IL-10的影響及其調控的信號通路，探討PCV2引起仔豬免疫抑制的機制，為PCV2發病機制研究提供新的思路，并為PCV2防控尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒PK-15 細胞系(無PCV污染)和PCV2-SH(AY686763，病毒滴度為1×10-5.5TCID50/mL),由本實驗室保存。

1.2 主要試劑兔抗PCV2 Cap多克隆抗體、兔抗NF-кB /p65多克隆抗體、兔抗CD81多克隆抗體和兔抗β-actin多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗TSG101多克隆抗體購自Sigma公司；兔抗磷酸化抑制性核因子кBα(p-IкBα)多克隆抗體購自美國Enzo Life Sciences公司；兔抗MyD88單克隆抗體購自美國Abcam公司；山羊抗兔 IgG-HRP、山羊抗兔IgG-FITC、TRIzol、反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒、兔抗組蛋白3(Histone H3)多克隆抗體、細胞核蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒和化學發光底物檢測試劑盒均購自上海碧云天生物公司；豬特異性IL-10 ELISA 試劑盒購自上海西唐生物科技股份有限公司；豬淋巴細胞分離液購自北京達科為生物技術有限公司。

1.3 淋巴細胞的分離培養3頭經檢測PCV2抗原陰性的35日齡斷奶仔豬，頸靜脈放血致死，無菌采集新鮮脾臟，去除表面血污及纖維組織，機械法剝離脾臟淋巴細胞，經200目不銹鋼網篩過濾分離細胞，1 500 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀。將細胞沉淀與淋巴細胞分離液=1∶1混勻，室溫水平轉子800 r/min離心30 min，小心吸取血漿層與分離液層中間的細胞層轉移至新離心管中，加入10% 1640培養基，室溫水平轉子250 r/min離心10 min，棄上清，重復洗滌2次，用10%的1640培養基重懸細胞。將細胞在37℃二氧化碳培養箱中培養2 h除去單核巨噬細胞，收集上清液即為淋巴細胞，將細胞密度調整為1×106/mL備用。

1.4 外泌體(Exo)的提取當生長良好的PK-15細胞融合度達到80%時，將PCV2-SH按MOI=1.0接種PK-15細胞，在二氧化碳培養箱中感染2 h后，換為用無外泌體血清配置的2%維持液，48 h后收集細胞上清液，提取外泌體，即為P-Exo。按照試劑盒說明書操作如下：4℃、2 000 r/min離心30 min去除死細胞，10 000 r/min離心30 min去除細胞碎片，上清液用0.22 μm濾器過濾去除微囊泡；將上清液轉移至新的離心管中，按照體積比Exosomes Concentration Solution試劑∶細胞上清液=1∶4加入，旋渦振蕩充分混勻，于4℃靜置2 h；將混合液10 000 r/min離心60 min，收集沉淀，用PBS充分混勻；將混懸液12 000 r/min離心30 min，上清液即富含外泌體顆粒；外泌體顆粒粗品轉入Exosomes Purification Filter中，3 000 r/min離心10 min，收集管底濾液即為P-Exo，純化后的P-Exo -80℃冰箱保存備用。提取未接毒PK-15細胞外泌體，標記為N-Exo。將外泌體樣本與RIPA裂解液按體積比1∶1混勻，置于冰上裂解10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清即為外泌體裂解組；BCA法測定外泌體濃度。

1.5 透射電鏡觀察將外泌體滴在2 mm銅網片上，用濾紙沿銅網片邊緣輕輕擦拭，吸收多余水分。樣品在室溫下用醋酸雙氧鈾溶液染色5 min，干燥10 min，在80 kV下用透射電鏡觀察樣品形態。

1.6 試驗設計將淋巴細胞隨機分為6組，分別是空白對照組、外泌體組(N-Exo)、PCV2組、PCV2外泌體組(P-Exo)、P-Exo裂解組(P-Exo lysis)和P-Exo 抑制劑組(P-Exo-BAY)。空白對照組為正常分離的淋巴細胞；N-Exo組接種N-Exo質量濃度為5.0 mg/L；PCV2組接種PCV2病毒MOI=1.0；P-Exo 組接種P-Exo質量濃度為5.0 mg/L；P-Exo lysis組將P-Exo超聲波破碎后再孵育淋巴細胞；P-Exo-BAY組細胞鋪板2 h后加入NF-κB抑制劑BAY 11-7082(終濃度50 mmol/L)，孵育2 h后換成新的細胞培養液，再接種P-Exo質量濃度為5.0 mg/L；培養24 h后收獲淋巴細胞和細胞上清液用于后續試驗。

1.7 間接免疫熒光檢測PCV2感染淋巴細胞取空白對照組、PCV2組和P-Exo組淋巴細胞置于黏附劑載玻片上，4%多聚甲醛固定，PBS洗滌3次，0.5% TritonX-100室溫20 min；PBS洗滌3次，5% BSA在37℃恒溫恒濕培養箱中1 h；PBS洗滌3次，加入PCV2 Cap多克隆抗體(1∶100稀釋)，37℃孵育 2 h;PBS洗滌3次，加入IgG-FITC熒光二抗(1∶200稀釋)，37℃孵育1 h;DAPI 室溫染藍30 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.8 qPCR檢測淋巴細胞TLRs mRNA變化 使用TRIzol方法提取淋巴細胞總RNA，根據說明書使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。qPCR反應體系由2 μL cDNA、10 μL SYBR Green、0.6 μL 上游引物、0.6 μL下游引物和6.8 μL雙蒸餾水組成。以β-actin為內參，檢測TLRs mRNA變化，引物序列見表1。

表1 TLRs和內參基因的引物序列及產物片段大小

1.9 ELISA檢測IL-10表達量將淋巴細胞分4組，分別加入終質量濃度為0,2.5,5.0,10.0 mg/L的P-Exo，于24,48 h后收集細胞上清液，按照 ELISA 試劑盒說明書檢測細胞培養上清液中IL-10含量。通過試驗確定外泌體的質量濃度為5.0 mg/L,檢測時間點為24 h。

1.10 Western blot檢測NF-κB/p65、p-IκB和My-D88蛋白含量用細胞核蛋白提取試劑盒提取淋巴細胞胞漿和胞核蛋白，具體步驟參考文獻[10]。將細胞漿和細胞核蛋白分別與5× SDS變性緩沖液混合煮沸5 min，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉印到PVDF膜，在37℃溫箱中5%脫脂乳封閉2 h后，在4℃冰箱孵育一抗(NF-кB /p65、p-IкBα、MyD88、Histone H3和β-actin，1∶1 000稀釋)過夜，室溫孵育二抗2 h，用ECL顯影液檢測，化學發光凝膠成像系統觀察結果。

2 結果

2.1 外泌體的鑒定透射電鏡觀察外泌體的形態和太小，結果如圖1A所示，提取的外泌體為杯狀小囊泡，雙層膜結構明顯，直徑為50～150 nm，大小不一。為進一步鑒定提取的外泌體，采用Western blot法檢測外泌體的標志蛋白CD81和TSG101，結果如圖1B所示，在不同來源外泌體中檢測到目的條帶，表明試驗中成功提取外泌體。

A.透射電鏡觀察外泌體的形態；B.Western blot檢測外泌體標志蛋白

2.2 PCV2感染PK-15細胞的外泌體鑒定將提取的外泌體進行Western blot檢測，結果如圖2所示，在P-Exo和PCV2感染的PK-15細胞中可以檢測到PCV2 Cap蛋白，正常PK-15細胞及其分泌的外泌體中不含Cap蛋白，表明P-Exo中含有病毒粒子成分。

圖2 Western blot鑒定外泌體

2.3 P-Exo對淋巴細胞的感染率間接免疫熒光法檢測P-Exo對淋巴細胞的感染率結果如圖3所示，PCV2 Cap蛋白染成綠色，細胞核染成藍色；在對照組中無陽性信號出現，在PCV2組和P-Exo組中檢測到陽性信號，主要位于細胞漿內，P-Exo組淋巴細胞陽性信號明顯多于PCV2組，表明外泌體在PCV2感染淋巴細胞中起重要作用。

圖3 P-Exo感染仔豬淋巴細胞(100×)

2.4 P-Exo對淋巴細胞分泌IL-10的影響將淋巴細胞分4組，分別加入終質量濃度為0.0,2.5,5.0,10.0 mg/L 的P-Exo，于24,48 h后收集細胞上清液，按照 ELISA 試劑盒說明書檢測細胞培養上清液中IL-10含量。結果如圖4所示，與對照組相比，5.0,10.0 mg/L的P-Exo孵育淋巴細胞24 h后IL-10的含量極顯著升高(P<0.01)，5.0,10.0 mg/L的P-Exo之間無顯著性差異，確定后續P-Exo的質量濃度為5.0 mg/L，檢測時間點為24 h。將PCV2或不同類型外泌體孵育淋巴細胞后，上清液中IL-10的濃度變化如圖5所示，與對照組相比，PCV2感染淋巴細胞后IL-10表達量顯著升高(P<0.05)，P-Exo接種淋巴細胞后IL-10表達量極顯著升高(P<0.01)，而正常PK-15細胞分泌的外泌體或P-Exo lysis對IL-10表達無明顯作用;淋巴細胞先孵育BAY 11-7082再接種P-Exo時，IL-10表達量顯著升高(P<0.05);與PCV2組和抑制劑相比，P-Exo組IL-10表達量顯著升高(P<0.05);結果表明P-Exo能夠促進淋巴細胞分泌IL-10。

圖4 不同質量濃度P-Exo對淋巴細胞分泌IL-10的影響

圖5 不同刺激物對淋巴細胞IL-10分泌作用

2.5 P-Exo對淋巴細胞TLRs mRNA轉錄的影響P-Exo感染淋巴細胞后，淋巴細胞TLRs mRNA 轉錄水平的變化如圖6所示。與對照組相比，P-Exo inhibitor組TLR2 mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.05)，其他組與對照組相比無顯著變化；與對照組相比，P-Exo組和P-Exo inhibitor組TLR3 mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.05)，其他組與對照組相比無顯著變化；與對照組相比，PCV2組TLR4 mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.05)，其他組與對照組相比無顯著變化；與對照組相比，P-Exo組和P-Exo inhibitor組TLR7 mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.05)，其他組與對照組相比無顯著變化，與PCV2組相比P-Exo組和P-Exo inhibitor組表達量顯著升高(P<0.05)；與對照組相比，Exo組、P-Exo組和P-Exo inhibitor組TLR8 mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.01)，其他組與對照組相比無顯著變化，與PCV2組相比P-Exo組和P-Exo inhibitor組表達量極顯著升高(P<0.01)；與對照組相比，P-Exo組和P-Exo inhibitor組TLR9 mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.01)，其他組與對照組相比無顯著變化，與PCV2組相比P-Exo組和P-Exo inhibitor組表達量顯著升高(P<0.05)。試驗結果表明， P-Exo主要改變Toll7/8/9 mRNA的表達。

2.6 P-Exo對淋巴細胞胞漿MyD88、p-IκBα和NF-κB/p65蛋白的影響P-Exo對淋巴細胞胞漿中MyD88、p-IκBα和NF-κB /p65蛋白的影響如圖7所示。MyD88蛋白水平與對照組相比，Exo組無顯著變化，PCV2組、P-Exo組、P-Exo lysis組和P-Exo inhibitor組顯著升高，以P-Exo組升高最顯著；p-IκBα蛋白水平與對照組相比，Exo組和PCV2組無顯著變化，P-Exo組顯著升高，P-Exo lysis組和P-Exo inhibitor組表達有降低趨勢，NF-κB /p65抑制劑能夠降低p-IκBα蛋白表達；NF-κB /p65蛋白水平與對照組相比，Exo組無顯著變化，PCV2組、P-Exo組、P-Exo lysis組和P-Exo inhibitor組呈降低趨勢，以P-Exo組降低最顯著。試驗結果表明，P-Exo能提高胞漿中MyD88表達，而NF-κB抑制劑對此無影響；P-Exo能促進IκBα的磷酸化過程，而NF-κB抑制劑能阻斷P-Exo對IκBα的磷酸化；P-Exo降低胞漿中NF-κB /p65含量，促進其入核。

2.7 P-Exo對淋巴細胞胞核NF-κB/p65蛋白的影響P-Exo對淋巴細胞胞核NF-κB /p65蛋白的影響如圖8所示。與對照組相比，Exo組、PCV2組、P-Exo lysis組和P-Exo inhibitor組無顯著變化，P-Exo組顯著升高。試驗結果表明，P-Exo能促進NF-κB/p65入核，p-IκBα磷酸化過程被抑制后，NF-κB/p65入核減少。

圖6 P-Exo對仔豬淋巴細胞中TLRs mRNA表達量的影響

圖7 不同刺激物對淋巴細胞漿蛋白的影響

圖8 不同刺激物對淋巴細胞核蛋白的影響

3 討論

外泌體(exosomes，Exo)是由活細胞分泌而來的微小囊泡，直徑為30～200 nm，浮密度為1.13～1.21 g/mL，具有脂質雙層膜結構，內容物比較復雜，包含了mRNA、miRNA、lncRNA和蛋白質，甚至細胞器；外泌體可通過細胞膜受體直接激活受體細胞，也可運輸內容物進入受體細胞，參與細胞間通訊。此外，許多病毒感染的細胞分泌的外泌體與正常細胞分泌的外體含量不同，它們也可能包含各種病毒蛋白、RNAs，甚至病毒粒子，因此病毒有可能利用外泌體進行傳播并感染靶細胞[11-12]。近年來的研究表明，外泌體在HIV-1、HCV、HAV和DENV等幾種病毒的傳輸中起重要作用，從HCV或HAV感染細胞中分離的外泌體被證明含有完整的病毒顆粒，并且能夠將感染傳播給其他細胞[13]。研究顯示，PRRSV感染細胞分泌的外泌體中含有M、N和GP5等結構蛋白，不含GP4蛋白[14]。在本研究中，我們成功提取了PK-15細胞分泌的外泌體，其形態、大小及其標志蛋白質CD81、TSG101都符合外泌體的特征。更重要的是P-Exo中包含PCV2的主要結構蛋白Cap蛋白，在正常PK-15細胞外泌體中不含有Cap蛋白，而PCV2 Cap 蛋白是上調豬肺泡巨噬細胞中 IL-10 表達的關鍵組分[15]。進一步用P-Exo感染淋巴細胞，IFA結果顯示在淋巴細胞內出現明顯的陽性信號，且與PCV2組相比，陽性信號增多，表明外泌體在PCV2感染淋巴細胞中起重要作用。

PCV2特征是病毒粒子無囊膜，基因組為環狀、閉合、單股的DNA，直徑17～20 nm，呈20面體對稱結構，PCV2粒子在CsCL中的浮密度為1.37 g/mL。PCV2基因組含有11個潛在開放閱讀框(ORF)即ORF 1～11，其中ORF1編碼病毒復制相關蛋白(Rep和Rep′)，ORF2編碼病毒的主要結構蛋白Cap蛋白；PCV2感染可引起機體免疫抑制，導致機體免疫平衡紊亂，易于感染其他疾病[16]。IL-10是一種由Th2細胞分泌，作為重要的免疫抑制性細胞因子能夠抑制Th1細胞合成IL-2和IFN-γ細胞因子，調節細胞的生長與分化，參與炎性反應和免疫反應，是公認的炎癥與免疫抑制因子。前期研究表明，IL-10通過抑制機體免疫反應促進病毒復制[17]。仔豬感染PCV2后組織中IL-10的表達量顯著上調[9,18]，而我們前期研究發現在體外試驗中，PCV2誘導淋巴細胞表達IL-10作用不顯著，這與KEKARAINEN等[19]研究報告相一致，表明PCV2可能不直接影響淋巴細胞。本試驗結果表明，P-Exo能夠促進淋巴細胞分泌IL-10，與單獨PCV2感染淋巴細胞相比，IL-10表達量顯著升高(P<0.05)；而將P-Exo裂解后再孵育淋巴細胞，則IL-10的表達量顯著降低，抑制劑BAY 11-7082降低 NF-κB /p65含量后IL-10的表達量顯著降低，表明P-Exo可通過NF-κB通路影響IL-10的表達。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是參與天然免疫的一類重要蛋白質分子，也是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。TLRs的主要信號途徑包括MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑，除TLR3外大多數TLRs介導的通路屬于MyD88依賴途徑。TLRs能夠促使IκB磷酸化而降解，IκB與NF-κB解離，游離的NF-κB入核啟動相應的基因轉錄[20]。Toll3/7/8/9定位于細胞內膜上，包括內質網、溶酶體和內含體等，可以識別在細胞內的病毒核酸物質，如雙鏈RNA、單鏈RNA和一些DNA病毒的雙鏈RNA中間產物；Toll2/4位于細胞膜上，主要識別一些病毒的包被蛋白。有研究發現，PCV2可改變巨噬細胞、淋巴細胞和PK-15細胞中TLRs的表達[21-23]。本試驗結果表明，P-Exo感染淋巴細胞后，可顯著提高淋巴細胞Toll7/8/9 mRNA的表達(P<0.01)，提高淋巴細胞Toll3 mRNA的表達(P<0.05)，而對Toll2/4 mRNA的表達無顯著作用。PCV2直接感染則主要影響Toll2/4/9 mRNA的表達；P-Exo破膜后再感染淋巴細胞則對淋巴細胞中Toll3/7/8/9 mRNA的表達無顯著性影響；抑制劑BAY 11-7082孵育淋巴細胞后，用P-Exo感染淋巴細胞對其Toll3/7/8/9 mRNA的表達也無顯著性影響。

IL-10表達過程中NF-κB信號轉導途徑起重要作用[24]。DU等[15]研究表明PCV2感染豬肺泡巨噬細胞能誘導IκB磷酸化，促進且NF-κB/p50入核，而p65則無明顯變化。Western blot結果顯示，P-Exo能夠顯著升高淋巴細胞胞漿MyD88和p-IκBα蛋白含量，降低胞漿NF-κB /p65的含量，升高細胞核NF-κB/p65的含量；NF-κB /p65抑制劑BAY 11-7 082能夠顯著下調胞漿中IκB的磷酸化，抑制NF-κB入核，降低IL-10的表達。

PCV2感染PK-15細胞分泌的外泌體包含PCV2 Cap蛋白，外泌體可提高PCV2對淋巴細胞的感染率，通過Toll7/8/9-MyD88-NF-κB信號通路促進淋巴細胞分泌IL-10。