miR-130a-3p與小鼠胰島素敏感性的相關性

李威特，江 霖，吳佳韓，陳 婷，羅君誼，孫加節，張永亮，習欠云

(華南農業大學 動物科學學院 廣東省動物營養調控重點實驗室/國家生豬種業工程技術中心，廣東 廣州 510642)

MicroRNA(miR)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們參與轉錄后基因表達的調控[1]。作為近年來研究的新的調控介導熱門分子，且在機體中參與了基本代謝中的能量代謝、糖類合成、脂肪合成、細胞發育等過程[2-4]；同時，microRNA可參與疾病的進程，作為疾病治療的新靶標[5-7]。此前，對參與胰島素調節的microRNA的研究發現，miR-378可以靶向降低p110α基因的表達，抑制胰島素信號的傳遞[8]；miR-183的表達減少，會提高牙髓細胞轉化為胰島細胞的分化效率[9]；另有研究發現，下調miR-181a可以上調Sirtuin-1基因表達，并改善胰島素敏感性。但是，目前對參與到胰島素信號傳導的microRNA并沒有全部被發現。本試驗為了研究潛在的microRNA參與到胰島素信號傳導的過程，選擇了5種microRNA(miR-146a-5p、miR-143a-3p、miR-125b-2、miR-130a-3p和miR-28a-3p)為研究目標，觀察胰島素對他們的影響，為之后進一步的研究提供有效的數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料人胰島素(I2643，Sigma)；PCR儀(2720thermalcycle，廣州吉泰生物科技有限公司)；實時熒光定量PCR儀(Stratagene，古泰生物科技有限公司)；羅氏血糖儀活力型(ROCHE，瑞士)。

1.2 實驗動物miR-130a全身性敲除小鼠由賽業(廣州)生物科技有限公司制備。試驗小鼠的擴繁和飼養于華南農業大學動物實驗中心，遵循SPF級動物飼養條件。實驗動物的飼養和應用遵照《美國國立衛生研究院實驗動物應用指南》進行，并通過了華南農業大學實驗動物倫理委員會的批準。

1.3 試驗設計與飼養管理

1.3.1胰島素注射試驗 選用60日齡80只生長性能相近SVF小鼠，隨機分為2組,每組40只，試驗組小鼠每克體質量注射胰島素0.01 mL(0.05 U/mL)，對照組注射等體積生理鹽水。2組均飼喂普通飼料，試驗期2周。其中，各組30只小鼠進行短期試驗，10只進行長期試驗。

1.3.2高脂飼喂試驗 選用60日齡生長性能相近的10只miR-130a敲除鼠和10只野生型小鼠，隨機分為2組飼喂高脂飼料，試驗期2周。普通飼料和高脂飼料均購買于廣東省醫學動物實驗中心。高脂飼料為60%脂肪熱能，普通飼料為5%脂肪熱能。在試驗期間，各組小鼠自由采食與飲食，光照與黑夜各12 h，溫度保持在25℃。

1.4 胰島素注射試驗

1.4.1短期試驗 小鼠提前4 h禁食，保持正常飲水，每克體質量注射胰島素0.01 mL(0.05 U/mL)，分別在0.5,1.0,2.0 h對小鼠頸部脫臼處死采取各組小鼠肝臟，置于-80℃冰箱保存。

1.4.2長期試驗 每48 h對小鼠注射胰島素，每克體質量注射0.01 mL(0.05 U/mL),14 d后小鼠頸部脫臼處死采取各組小鼠肝臟，置于-80℃冰箱保存。

1.5 胰島素耐受試驗(ITT)與葡萄糖耐受試驗(GTT)

1.5.1ITT試驗 小鼠提前4 h禁食，保持正常飲水，在開始注射前，用剪刀剪去小鼠尾巴末端1～2 mm，輕輕擠壓小鼠尾巴，讓血液富集成1滴，用血糖儀測定血糖，測定值認定為 0 min 的血糖值;適應30 min后，給小鼠注射胰島素溶液，每克體質量注射0.01 mL(0.05 U/mL)，在 30，60，90，120 min測定每只小鼠各個時間點的血糖值。

1.5.2GTT試驗 小鼠提前16 h禁食，保持正常飲水，在開始注射前，用剪刀剪去小鼠尾巴末端1～2 mm，輕輕擠壓小鼠尾巴，讓血液富集成1滴，用血糖儀測定血糖，測定值認定為 0 min 的血糖值;適應30 min后，給小鼠注射20 %葡萄糖溶液，每克體質量注射0.01 mL，在 30，60，90，120 min測定每只小鼠各個時間點的血糖值。

1.6 microRNA靶基因預測通過starBase(http://starbase.sysu.edu.cn)網站對挑選的miRs進行靶基因預測。

1.7 實時熒光定量PCR組織中總RNA的提取依據TRIzol 一步法的說明書進行，純化并定量后，取2 μg總RNA逆轉錄合成cDNA，設計的反轉錄引物如表1。然后采用SYBR GreenⅠ Real-time PCR的方法檢測目的基因的相對表達量，設計的定量引物如表2。

表1 反轉錄引物

表2 定量引物

1.8 數據處理采用SPSS 17.0軟件進行數據統計分析，兩組間采用t-test檢驗進行比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 胰島素對相關microRNA表達影響注射胰島素后可影響相關microRNA的表達，在短期試驗中，注射胰島素后，不同時間對microRNA的表達效果不同，說明胰島素對microRNA表達影響存在時效性。在注射胰島素0.5 h后，與對照組相比，試驗組中miR-146a-5p、miR-143a-3p、miR-125b-2表達量顯著下調，miR-130a-3p表達量顯著上調(P<0.05)，miR-28a-3p表達量則不變(圖1A)；在注射胰島素1.0 h時，miR-146a-5p、miR-143a-3p、miR-125b-2表達量顯著下調(P<0.05)，miR-130a-3p表達量顯著上調(P<0.05)，miR-28a-3p表達量則不變，且與0.5 h相比下調與上調的趨勢更顯著(圖1B)；在2.0 h時，2組的各microRNA表達量不存在顯著性差異(圖1C)。另外，在1.0 h時檢測相關基因的表達量，與對照組相比，試驗組中GSK、HK、CD36、FATP1基因表達顯著的下調(P<0.05)(圖1D);在長期試驗后，與對照組相比，試驗組中miR-146a-5p、miR-143a-3p、miR-125b-2表達顯著下調(P<0.05),而miR-130a-3p表達顯著上調(P<0.05)(圖1E)。另外檢測相關基因的表達量，與對照組相比，試驗組中GSK和HK基因表達顯著下調(P<0.05)，GS和FATP1基因表達是顯著上調(P<0.05)，而CD36則差異不顯著(圖1F)。

2.2 小鼠miR-130a敲除后對胰島素敏感性的影響由圖2可以得知，miR-130a在胰島素調節的過程中起著一定的作用。miR-130a敲除可導致小鼠的葡萄糖耐受以及胰島素抵抗，可以發現試驗組胰島素抵抗的曲線下面積(AUC)顯著大于對照組(P<0.05)(圖3A，C)；試驗組中葡萄糖耐受試驗的AUC顯著大于對照組(P<0.05)(圖3B，D)。在肝臟中檢測有關基因的表達也發現，試驗組中GSK、HK表達量顯著下調(P<0.05)，CD36、FATP1、GS基因表達量顯著上調(P<0.05)(圖3E)。

A.在注射胰島素0.5 h后肝臟中相關microRNA的表達量;B.在注射胰島素1.0 h后肝臟中相關microRNA的表達量;C.在注射胰島素2.0 h后肝臟中相關microRNA的表達量;D.在注射胰島素1.0 h后肝臟中相關基因的表達量;E.連續注射14 d后肝臟中相關microRNA的表達量;F.連續注射14 d后肝臟中相關基因的表達量。*.表示試驗組與對照組比較差異性顯著(P <0.05)；**.表示試驗組與對照組比較差異性極顯著(P <0.01)。下同

圖2 相關microRNA靶基因預測

A.胰島素耐受試驗;B.葡萄糖耐受試驗；C.ITT曲線下面積(AUC)；D.GTT曲線下面積(AUC)；E.肝臟中相關基因的表達量

3 討論

3.1 胰島素對相關microRNA表達影響microRNA作為一種信號分子，能協助機體內組織間相互調節信號傳遞，并且利用特異性靶向結合靶基因的特點參與機體基本活動的調節，特定的堿基序列決定了靶基因的特異性，進而可實現精準調節；microRNA參與調節揭露了一種新信號互作方式，成為維護機體穩態的重要組成部分。其中，miR-146a-5p已經被證實參與機體風濕性關節炎、前列腺癌、胰腺癌等生命活動[10]。miR-146a-5p在體內外周循環的增加可以被當成機體產生胰島素抵抗的生物標志分子[11-12]；miR-143a-3p已經被證實參與了脂肪發育、心肌肥大、平滑肌發育及癌癥發生等生物學過程[13]，在胰島素調節中，胰島素信號傳遞的受阻會上調miR-143a的表達量[14]。miR-125b-2已經被證實參與脂肪發育、精子生成、癌細胞發育、糖酵解等生命活動[15]，miR-125b-2的降低可以增加胰島素信號的傳遞[16-17]。miR-130a已經被證實參與脂肪發育、平滑肌活力調節、血管重構、抑制癌癥發生等生命活動[18]。有研究表明，miR-130a參與了胰島素信號的傳遞，在肝臟中表達增加有利于提高肝臟合成糖原的能力[19]。而miR-28a參與相關炎癥發生[20]，而對于胰島素調節相關的研究較少。經過靶基因的預測以上microRNA除去miR-28a，其他均有參與胰島素調節的作用中。從定量的結果可以發現，小鼠在注射胰島素0.5 h后miR-146a-5p、miR-143a-3p、miR-125b-2、miR-130a的表達水平均發生變化(P<0.05)，1.0 h時變化程度增大,到2.0 h時試驗組與對照組相比無顯著性差異；而miR-28a表達量始終無顯著性差異。可以看出胰島素對microRNA表達量的影響存在時效性，而連續注射胰島素14 d后發現胰島素對miR-146a-5p、miR-143a-3p、miR-125b-2、miR-130a的表達量已經產生不可恢復的影響。

3.2 小鼠miR-130a敲除后對胰島素敏感性的影響此前的研究發現,miR-130a可以參與脂肪合成代謝的調控[21]，同時脂肪的合成代謝是胰島素調節通路中的重要部分，而且根據靶基因預測的結果，可得miR-130a-3p是可以通過抑制PHLPP2基因的表達，進而提高組織對糖類的吸收轉運。本研究構建了全身性敲除miR-130a的小鼠，通過高脂誘導飼養發現在敲除鼠中產生了胰島素抵抗與葡萄糖的耐受。另一方面，基因敲除的小鼠中，糖類合成的相關基因GSK、HK的表達量顯著下調(P<0.05)；脂肪合成的相關基因CD36、FATP1的表達量顯著上調(P<0.05)。可以得出miR-130a不僅受到胰島素調節，而且在缺失的時候影響胰島素信號的傳遞。已知miR-130a可以通過靶向PPAR-γ基因，抑制脂肪的合成代謝[21]；另外可以上調Gax基因的表達，促進平滑肌細胞的生成[22]；還發現在胰島素抵抗的小鼠中，增加miR-130a的表達量可以恢復胰島素的敏感性19,23]。miR-130a-3p不僅影響脂質代謝，也影響糖類代謝，可大膽推測miR-130a-3p不僅是機體組織器官中參與胰島素調節的重要組成部分，而且是連接糖脂代謝的重要介質。關于miR-130a具體參與胰島素調節的分子機制尚需進一步的探討，希望本研究可對進行此方面的研究提供有效的線索以及思路。