地衣芽孢桿菌對熱應激公兔甲狀腺和甲狀旁腺組織的影響

韓 昱，張立永，張富梅，馮宇飛，金圓圓

(1.河北北方學院 實驗動物中心,河北 張家口 075000；2.河北北方學院 動物科技學院,河北 張家口 075000)

在家兔養殖過程中，應激是造成公兔生殖機能下降的直接原因之一[1-2]，據報道，熱應激使公兔甲狀腺的組織結構處于功能低下狀態，從而影響T3和T4的正常分泌，降低精液品質[3-4]。熱應激給家兔帶來的不利影響，大大降低了種兔的利用價值，嚴重制約了養兔業的發展。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) 是芽孢桿菌中具有較強應用潛力的益生菌之一，在日糧中添加地衣芽孢桿菌可促進畜禽的生長[5-7]，改善腸道黏膜形態，促進有益菌的增殖，增強機體抗熱應激能力[8-9]。雖然對熱應激的研究報道較為普遍，但是關于地衣芽孢桿菌對熱應激家兔甲狀腺的影響尚未見報道。本試驗通過光鏡和電鏡觀察公兔甲狀腺結構變化，揭示地衣芽孢桿菌在抗熱應激中的作用機理，為生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 基礎飼糧、活菌制劑及試驗動物基礎飼糧原料為玉米38%、麩皮7%、豆粕17%、苜蓿草粉24%、燕麥12%、骨粉1%、其他1%，制成顆粒飼料。營養成分：消化能(DE)11.09 MJ/kg，粗蛋白(CP)17.06%，粗纖維(CF)10.05%。地衣芽孢桿菌活菌制劑的活菌含量為 2×1010CFU/g，購于北京挑戰生物技術有限公司；試驗動物為年齡相同、體質量3.5～4.5 kg、體況良好的成年塞北兔種公兔。

1.2 試驗設計選擇18只種公兔，隨機分為常溫組、熱應激對照組和地衣芽孢桿菌試驗組，每組6只。常溫組兔舍溫度控制在20～25℃，熱應激對照組和地衣芽孢桿菌試驗組兔舍溫度模擬炎熱夏季溫度變化，采用全自動智能控溫電加熱暖風機調節溫度。9:00-12:00溫度控制在26～32℃，12:00-16:00溫度控制在33～35℃，16:00-22:00溫度控制在28～30℃，22:00-3:00溫度控制在26～28℃，凌晨3:00-9:00溫度控制在25～26℃。公兔單籠飼養，常溫組和熱應激對照組飼喂基礎飼糧，地衣芽孢桿菌試驗組飼喂基礎飼糧+1 000 mg/kg地衣芽孢桿菌(前期試驗已完成添加量梯度篩選工作[10])。7 d 預試期后轉為正試期飼喂15 d，保證兔舍的清潔衛生，定期消毒。

1.3 測定指標與觀察

1.3.1血漿皮質醇含量和甲狀腺指數測定 分別于試驗前及試驗5,10,15 d采集兔血液，制備血漿，測定血漿皮質醇含量(放射免疫法)。在試驗期末空腹12 h后測體質量，摘取甲狀腺測其質量，計算甲狀腺指數。

1.3.2光鏡下觀察甲狀腺組織 取1.3.1中部分甲狀腺組織固定于4%甲醛磷酸緩沖液中(pH7.2～7.4)，待充分固定后，按照常規方法進行7次酒精脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，制作切片，HE染色后，采用YD300型數字攝像機及圖像處理系統分析甲狀腺組織變化情況。

1.3.3透射電鏡觀察甲狀腺細胞變化 取1.3.1中部分甲狀腺組織，采用2.5%戊二醛固定24 h以上，用磷酸緩沖液漂洗，再用1%餓酸固定，不同濃度的乙醇脫水，然后包埋、固化，做超薄切片，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，采用JEMCXⅡ型透射式電子顯微鏡觀察其超微結構。

2 結果

2.1 地衣芽孢桿菌對熱應激公兔血漿皮質醇和甲狀腺指數的影響

2.1.1地衣芽孢桿菌對熱應激公兔血漿皮質醇的影響 由表1可知，在試驗前測定各組血漿皮質醇水平差異均不顯著(P>0.05)。5，10 d熱應激對照組和地衣芽孢桿菌組均極顯著高于常溫組(P<0.01)，且熱應激對照組高于地衣芽孢桿菌組有顯著性差異(P<0.05)。15 d熱應激對照組繼續下降，但顯著高于地衣芽孢桿菌組(P<0.05)，極顯著高于常溫組(P<0.01)，地衣芽孢桿菌組顯著高于常溫組(P<0.05)。

2.1.2地衣芽孢桿菌對熱應激公兔甲狀腺指數的影響 由表2可知，常溫組、熱應激對照組和地衣芽孢桿菌組甲狀腺質量和甲狀腺指數兩兩比較有極顯著性差異 (P<0.01)；熱應激公兔甲狀腺質量和指數為常溫組>地衣芽孢桿菌組>熱應激對照組。

2.2 地衣芽孢桿菌對熱應激種公兔甲狀腺組織結構變化的影響結果見圖1。常溫組在試驗15 d、10×10倍光鏡下觀察甲狀腺組織無明顯變化，濾泡形態呈少量圓形或較多扁橢圓形，濾泡邊緣整齊光滑，直徑20～65 μm，濾泡基膜由單層上皮細胞構成，細胞核呈圓形或卵圓形，偏于濾泡基膜處；胞內基質為嗜酸性染色，基質中可見有散在的濾泡上皮細胞；濾泡旁細胞分布較廣，存在于濾泡之間或上皮細胞之間，血管竇清晰可見。熱應激對照組濾泡變化較大，濾泡基膜不規則，有的基膜破裂，分界不明顯，可略見濾泡上皮存在，旁細胞少而不完整；基膜上皮細胞核及旁細胞核溶解，觀察不到完整的細胞結構，血管破裂。地衣芽孢桿菌組部分濾泡分界不清，濾泡上皮細胞較為清晰，旁細胞較多，血管竇較為清晰可見。

表2 地衣芽孢桿菌對熱應激公兔甲狀腺指數的影響

2.3 地衣芽孢桿菌對熱應激公兔甲狀腺濾泡上皮細胞超微結構的影響結果見圖2。試驗公兔電鏡下常溫組甲狀腺濾泡上皮細胞結構清晰，細胞膜結構完整，細胞之間通過橋粒連接，細胞核大而圓，染色質常染色質較多，且分布均勻，胞質中含有豐富的溶酶體、高爾基體和線粒體，線粒體為短桿狀發育正常，粗面內質網較發達，含有少量膠質小泡。地衣芽孢桿菌組與常溫組比較，細胞核縮小，細胞核異染色質增多，且邊集，出現初級溶酶體，線粒體嵴擴張，斷裂，空泡化較為明顯，高爾基體和粗面內質網較為發達。熱應激對照組濾泡上皮細胞變化顯著，多呈扁平狀，細胞核萎縮嚴重，小而扁平，邊緣皺縮，核內異染色質增多；胞質中可見斷裂的粗面內質網，胞質空泡化較為明顯；少見高爾基體，斑馬體樣溶酶體較多；線粒體嵴斷裂，擴張空泡化嚴重。

A.常溫照;B.地衣芽孢桿菌組;C.熱應激組

A.常溫照;B.地衣芽孢桿菌組;C.熱應激組

2.4 地衣芽孢桿菌對熱應激公兔甲狀旁腺嗜酸性細胞超微結構觀察結果見圖3。常溫組甲狀旁腺嗜酸性細胞胞質中線粒體豐富，圓形短桿狀較多，嵴明顯；粗面內質網和高爾基體不發達。地衣芽孢桿菌組細胞核異染色質邊集，細胞膜較為清晰，線粒體嵴輕微擴張，可見擴張的內質網。熱應激組嗜酸性細胞核固縮明顯，核內異染色質增多，線粒體嵴斷裂，空泡化程度高，線粒體顆粒增多。

A.常溫組甲狀旁腺嗜酸性細胞；B.地衣芽孢桿菌組甲狀旁腺嗜酸性細胞；C.熱應激組甲狀旁腺嗜酸性細胞；D.熱應激組甲狀旁腺嗜酸性細胞線粒體基質顆粒增多

3 討論

3.1 地衣芽孢桿菌對血漿皮質醇和甲狀腺指數的影響熱應激可引起機體發生一系列生理反應，它通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸系統合成和分泌激素來實現對機體的影響。據報道，給大鼠35～38℃持續熱應激能顯著提高大鼠血清皮質醇含量，熱應激1 d后達到高峰，以后開始逐漸降低[11]。另據報道，長時間熱應激可使下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸處于長期亢奮狀態，功能失常，引起皮質醇分泌下降[12]。本試驗結果與前者研究略有區別，與后者報道相一致。本試驗是模擬夏季高溫對家兔持續熱應激，熱應激對照組5 d時血漿皮質醇含量極顯著高于常溫組，且達到高峰，隨著熱應激持續時間的延長血漿皮質醇含量逐漸降低，到15 d時略高于常溫組，表明長時間熱應激引起了下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸機能減退，皮質醇合成分泌減少。而飼糧中添加地衣芽孢桿菌能明顯緩解這種變化趨勢，顯示出地衣芽孢桿菌的抗熱應激作用。

熱應激也可通過下丘腦-垂體-甲狀腺軸系統來影響甲狀腺的分泌功能，甲狀腺分泌的甲狀腺激素具有促進機體代謝、增加機體產熱的作用，參與機體對冷熱的調節。熱應激對畜禽影響的作用機制報道較為多見[13-14]。本試驗結果表明，經過高溫處理后的試驗公兔，可使甲狀腺質量下降，甲狀腺指數降低，與參考文獻[15] 中熱應激可使甲狀腺萎縮結果相一致。甲狀腺的實質主要由許多甲狀腺濾泡組成，而濾泡基膜由許多單層上皮組成，熱應激使其單層上皮細胞胞核及旁細胞核溶解，胞膜輪廓邊界不清，胞質出現空泡化明顯，因此改變了濾泡的形態結構，影響甲狀腺激素T3、T4的合成和分泌，這是導致公兔生殖機能降低的原因。本試驗結果顯示，地衣芽孢桿菌組可提高甲狀腺指數，緩解濾泡上皮細胞核溶解核胞質發生空泡化的速度，保持濾泡上皮細胞的完整性。

3.2 地衣芽孢桿菌對甲狀腺濾泡上皮細胞和甲狀旁腺嗜酸性細胞超微結構的影響甲狀腺濾泡上皮細胞是產生甲狀腺素的重要場所。本試驗電鏡觀察結果顯示，熱應激時濾泡上皮細胞核萎縮嚴重，胞質中粗面內質網斷裂明顯，線粒體減少，擴張空泡化嚴重，斑馬體樣溶酶體增多，胞質空泡化嚴重，證明了熱應激對甲狀腺的影響程度。熱應激時細胞氧化磷酸化減少，使細胞缺少能量的供應，蛋白質合成受阻，從而影響細胞的結構和功能，這一觀點從前期甲狀腺血漿T3、T4降低的測定結果也可得到驗證[10，16-17]。而地衣芽孢桿菌組電鏡下甲狀腺濾泡上皮細胞變化較熱應激組小，溶酶體較多，有初級溶酶體出現，線粒體嵴擴張輕微，高爾基體和粗面內質網較為發達，說明熱應激下飼糧添加地衣芽孢桿菌對維持細胞的結構與功能的完整性起積極作用。甲狀旁腺中的嗜酸性細胞可能與疾病的發生有關，本試驗中熱應激組甲狀旁腺嗜酸性細胞電鏡觀察核固縮明顯，核內異染色質增多，線粒體嵴斷裂，空泡化程度高，線粒體顆粒增多。而地衣芽孢桿菌組嗜酸性細胞變化較熱應激組輕，細胞膜較為清晰，線粒體嵴出現輕微擴張，有不發達的粗面內質網存在，說明地衣芽孢桿菌在飼糧中添加有利于提高機體抵抗力，恢復機體正常的生理功能 。

本試驗結果表明，在熱應激種公兔飼糧中添加1 000 mg/kg的地衣芽孢桿菌，可顯著降低熱應激公兔血漿皮質醇含量，緩解熱應激對甲狀腺的損傷，對保持甲狀腺濾泡上皮細胞形態和功能的完整性起決定作用，對熱應激造成的甲狀旁腺嗜酸性細胞損傷也有緩解作用。