雞源鴨疫里默桿菌的分離鑒定及ompA基因遺傳進化分析

李富祥，趙文華，宋建領，朱建波，楊仕標

(云南省畜牧獸醫科學院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224)

里默桿菌屬于黃桿菌綱(Flavobacteriia)、黃桿菌目(Flavobacteriaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriales)、里默桿菌屬(Riemerella),該屬包括鴨疫里默桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)和鴿里默桿菌(Riemerellacolumbina，RC)、鴿咽喉里默桿菌(Riemerellacolumbipharyngis)3個種。其中，RA呈世界性分布，主要感染鴨，鵝、火雞和其他鳥類感染較少見[1-2]，雞RA感染十分罕見[3]。RA感染又稱新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合征、鴨疫敗血癥和傳染性漿膜炎，該病廣泛分布于世界各國。我國郭玉璞等[4]于1982年首次分離到鴨源RA，之后諸多省份均有RA感的報道，給養鴨業造成嚴重的經濟損失。近年來，我國福建[5]、江蘇[6]和廣東[7-8]等省份均有鵝源RA分離鑒定的報道。到目前為止，未見我國雞源RA分離鑒定的報道。

2020年1月，云南省昆明市某養雞場仔雞(鐵腳麻)發生一種臨床癥狀以精神沉郁、呼吸困難、咳嗽、打噴嚏、鼻腔有大量黏液性分泌物為特征，病理變化以嚴重腹水、心包炎和肝周炎為特征的病例。該病發病率為15.0%，病死率為46.7%，給養殖場造成較大的經濟損失。為查明病因，我們對該病例進行細菌學診斷，從病死雞肝臟分離到8株革蘭陰性多形桿菌，經形態學和16S rDNA分析鑒定為RA。本試驗還對8株雞源RA分離株ompA基因(outer membrane protein A gene，ompA)及其推導的蛋白(outer membrane protein A，OmpA)序列遺傳進化特征進行分析，為我國雞源RA感染的防制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑營養瓊脂、麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix和Trans 2k DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司；青霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻吩、頭孢克羅、頭孢噻肟、卡那霉素片、慶大霉素、氧氟沙星、磺胺甲噁唑藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司；氟苯尼考藥敏紙片購自英國OXOID公司。

1.2 菌株10株云南鴨源RA分離株RA-1、RA-2、RA-3、RA-10、RA-22、RA-23、RA-33、RA-36、RA-37和RA-39由云南省畜牧獸醫科學院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保藏。

1.3 引物設計細菌16S rDNA上游引物27F(A) 和下游引物1492R(T)按參考文獻[9]設計；ompA基因上游引物Pf和下游引物Pr按參考文獻[10]設計；2對引物均由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.4 病理剖檢將病死雞剖檢，觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、輸卵管等病理變化，同時采集肝臟樣品，4℃ 保存，用于細菌分離鑒定。

1.5 細菌分離取肝臟劃線接種營養瓊脂平板，37℃、5%CO2培養過夜，挑單菌落進行純培養，挑取菌落制作涂片，革蘭染色鏡檢，觀察菌體形態。同時將分離株接種麥康凱瓊脂平板，37℃、5%CO2培養過夜，觀察生長特性。

1.6 16S rDNA和ompA基因測序用細菌基因組提取試劑盒分別提取各雞源分離株以及10株云南鴨源RA分離株RA-1、RA-2、RA-3、RA-10、RA-22、RA-23、RA-33、RA-36、RA-37和RA-39的基因組DNA作為模板，采用引物27F和1492R PCR擴增16S rDNA基因，采用引物Pf和Pr PCR擴增ompA基因。PCR反應條件均為：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃延伸5 min。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序，提交GenBank數據庫獲得基因收錄號。

1.7 16S rDNA進化分析將8株雞源RA分離株16S rDNA基因在GenBank數據庫中進行Blust比對，并下載不同國家和地區、不同分離源動物(鴨和鵝)參考株的基因序列共28個，用Clustal_X 1.83軟件進行多序列比對分析，用MEGA 4.0.2軟件構建系統進化樹(Neighbor-Joining方法，bootstrap values值設定為1 000)，選擇黃桿菌科模式菌株Flavobacterium aquatile LMG4008作為進化樹的外群。用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進行核苷酸序列比對，分析16S rDNA基因的同源性。

1.8ompA基因進化分析將8株雞源RA分離株ompA基因在GenBank數據庫中進行Blust比對，并下載不同國家和地區、不同分離源動物(鴨和鵝)參考株的基因序列共28個，用Clustal_X 1.83軟件進行多序列比對分析，用MEGA 4.0.2軟件構建系統進化樹(Neighbor-Joining方法，bootstrap values值設定為1 000)。用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進行核苷酸序列比對，分析ompA基因的同源性。

1.9 OmpA蛋白序列進化分析用DNAstar軟件包中的EditSeq軟件將8株雞源RA分離株ompA基因序列推導為蛋白序列，將雞源分離株OmpA蛋白序列在GenBank數據庫中進行Blust比對，并下載不同國家和地區、不同分離源動物(鴨和鵝)參考株的基因序列共27個，用Clustal_X 1.83軟件進行多序列比對分析，用MEGA 4.0.2軟件構建系統進化樹(Neighbor-Joining方法，bootstrap values值設定為1 000)。用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進行蛋白序列比對，分析OmpA蛋白的同源性。

1.10 藥敏試驗參考文獻[11]和 CLSI20015 推薦的 Kirby- Bauer方法，測定各分離株對10種抗菌藥物的敏感性。

2 結果

2.1 病理剖檢將病死雞剖檢，可見全部8只病死雞病理變化一致，均表現為腹部膨大，內有大量淡黃色漿液；心包膜表面有大量淡黃色纖維蛋白附著；肝臟表面有大量淡黃色纖維蛋白附著(圖1)。

圖1 心包膜和肝臟表面有大量纖維蛋白附著

2.2 細菌分離8份雞肝臟病料分別劃線接種營養瓊脂，37℃培養過夜后，均長出大量純粹灰白色中等大小菌落，菌落凸起、濕潤、光滑、邊緣整齊。分別挑單菌落純培養后分離到8株雞源細菌，編號分別為RA-20011、RA-20012、RA-20013、RA-20014、RA-20015、RA-20016、RA-20017和RA-20018，8株分離株革蘭染色均呈陰性多形桿菌(圖2)。8株雞源分離株在麥康凱瓊脂上均不生長。

圖2 分離株革蘭染色形態(1 000×)

2.3 16S rDNA和ompA基因測序8株雞源分離株16S rDNA基因和ompA基因的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分別得到約為1 500 bp，和1 200 bp的條帶，與預期的1 500，1 154 bp相符，鑒定正確。將PCR產物進行測序，序列提交GenBank數據庫獲得基因登錄號。8株雞源分離株16S rDNA基因登錄號分別為MT367923～MT367930，ompA基因登錄號分別為MT380216～MT380223。9株云南鴨源RA分離株(RA-23基因序列未提交)16S rDNA基因登錄號分別為MT367914～MT367922，10株云南鴨源RA分離株ompA基因登錄號分別為MT380206～MT380215。

2.4 16S rDNA進化分析系統進化樹顯示，8株雞源分離株與22株RA參考株形成一個大的進化分支(圖3)，8株雞源分離株與22株RA參考株之間的同源性為98.8%～100.0%，與RA模式菌株ATCC11845之間的同源性為99.3%～99.8%。8株分離株形成一個小的進化分支(圖3)，之間的同源性為99.7%～100.0%。3株R.columbipharyngis形成第2個大的進化分支(圖3)。3株R.columbina形成第3個大的進化分支(圖3)。8株雞源分離株與R.columbipharyngis和R.columbina分離株間的同源性為96.3%～96.4%。進化分析表明，8株雞源分離株與RA模式菌株ATCC11845以及其他RA參考株之間的遺傳進化關系最近，與R.columbipharyngis和R.columbina分離株遺傳進化關系較遠，將8株分離株鑒定為RA。

圖3 16S rDNA系統進化樹

2.5ompA基因進化分析系統進化樹顯示，8株雞源RA分離株與3株印度鴨源分離株KML1、KML2、KML3以及1株中國臺灣地區鵝源分離株KS9901-G形成一個大的進化分支(圖4)，與KML1、KML2、KML3、KS9901-G之間的同源性為94.0%～99.6%，其遺傳進化關系最近。8株雞源RA分離株形成一個獨立的小進化分支(圖4)，之間的同源性為100%。其他19株鴨源RA和5株鵝源RA分離株形成另一個大的進化分支(圖4)，與8株雞源RA分離株之間的同源性為88.1%～93.6%，與8株雞源RA分離株間的遺傳進化關系較遠。與模式菌株ATCC11845相比較，8株雞源RA分離株ompA基因均發生99個核苷酸位點的突變。

2.6 OmpA蛋白序列進化分析系統進化樹顯示，8株雞源RA分離株形成第1個大的進化分支(圖5)，之間的同源性為100%。3株印度鴨源分離株KML1、KML2和KML3形成第2個大的進化分支(圖5)，之間同源性為96.0%～99.7%。1株中國臺灣地區鵝源分離株KS9901-G形成第2個獨立大的進化分支(圖5)。其他RA參考株形成第4個大的進化分支(圖5)，之間的同源性為92.3%～100%。8株雞源RA分離株與鴨源分離株之間的同源性為90.6%～96.9%，與鵝源分離株之間的同源性為92.3%～99.4%，其中與鵝源分離株KS9901-G之間的同源性為99.4%，遺傳進化關系最近。與RA模式菌株ATCC11845相比較，8株雞源RA分離株OmpA蛋白均發生19個核苷酸位點的突變。

2.7 藥敏試驗藥敏試驗結果顯示，8株雞源RA分離株對青霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻吩、頭孢克羅、頭孢噻肟、卡那霉素片、慶大霉素、氧氟沙星、磺胺甲噁唑和氟苯尼考均敏感。

3 討論

RA病呈世界分布，嚴重危害養鴨業的發展。鵝RA感染時有報道，雞RA感染報道十分罕見。

圖4 ompA基因系統進化樹

圖5 OmpA蛋白系統進化樹

病鴨和病鵝病理特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎。本研究從一起纖維素性心包炎、肝周炎和嚴重腹水雞病例中分離到RA，證實了我國雞RA感染的存在。本研究中雞病例纖維素性心包炎、肝周炎病理特征與鴨、鵝鴨疫RA感染的病理特征相似，但在本試驗雞病例中，約80%病雞還表現出了嚴重的腹水病理特征，此特征與鴨和鵝鴨疫RA感染的病理特征不同。本研究中的8株雞源RA(RA-20011、RA-20012、RA-20013、RA-20014、RA-20015、RA-20016、RA-20017和RA-20018)能夠自然感染雞，導致漿膜炎特征病變和死亡，可能與分離株的宿主嗜性發生改變相關。本試驗在我國分離到雞源RA，并系統報道雞源RA自然感染的臨床癥狀和病理變化特征，以及雞源RA的培養特性、菌體形態特征和藥物敏感性。8株雞源RA分離株對阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢噻吩等10種抗菌藥物敏感，選擇阿莫西林克拉維酸鉀對該起病例進行治療，效果良好。

16S rDNA基因鑒定試驗中，8株雞源RA分離株與其他全部22株RA參考株形成第1個大的進化分支，8株雞源分離株與22株RA參考株之間的同源性為98.8%～100.0%，與RA模式菌株ATCC11845之間的同源性為99.3%～99.8%；另外16S rDNA基因Blust比較結果顯示，8株雞源分離株與全部100株RA參考株間的同源性為99.3%～99.9%，具有很高的同源性，16S rDNA基因分析數據結合分離株的菌落、菌體形態學特征，最終將8株分離株鑒定為RA。

ompA基因Blust比較結果顯示，8株雞源RA分離株與3株印度鴨源分離株KML1、KML2 KML3以及1株我國臺灣鵝源分離株KS9901-G之間的同源性為97.9%～99.7%，與其他RA參考株間的同源性均小于94%。進化分析顯示,8株雞源RA分離株與3株印度鴨源分離株KML1、KML2 KML3以及1株我國臺灣地區鵝源分離株KS9901-G形成一個大的進化分支，與KML1、KML2 KML3、KS9901-G之間的同源性為94.0%～99.6%，其遺傳進化關系最近。由此推測RAompA基因進化與分離來源地域(印度、中國大陸、中國臺灣地區)和宿主種類(雞、鴨、鵝)無相關性，此結論與參考文獻[12] 的報道相一致。

OmpA蛋白Blust比較結果顯示，8株雞源RA分離株與1株我國臺灣地區鵝源分離株KS9901-G之間的同源性為99.7%，與其他RA參考株間的同源性均小于97%。進化分析顯示，4株中國臺灣地區鵝源RA分離株27A、PT0001-G、PT9101和PT9901位于第4個大的進化分支中，而另1株中國臺灣地區鵝源分離株KS9901-G位于第3個大的進化分支中，由此推測RA OmpA蛋白進化與分離來源地域不具有相關性，此結論與參考文獻[12] 的報道相一致。8株雞源RA分離株形成一個獨立的大的進化分支，由此推測RA OmpA蛋白進化與宿主種類(雞、鴨、鵝)具有一定的相關性，此結論與參考文獻[12] 的報道相一致，其原因可能是由于參考文獻[12]的OmpA蛋白進化分析所用菌株僅包括鴨源和鵝源RA分離株，不包含雞源RA分離株。